TRa1基因转录后小片段P28、P43在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

李仕亮 徐 雷 邵国安 孙纷纷 孙林庸 薛 军

TRa1基因转录后小片段P28、P43在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

李仕亮1徐 雷2邵国安2孙纷纷3孙林庸4薛 军5

目的 分析TRa1基因转录后小片段P28、P43在甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)组织中的表达水平及其与临床病理的关系。方法 采用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)和凝胶电泳法分别扩增目的片段和分离不同片段的条带，再利用紫外透射分析仪扫描各条带的光密度来检测31例PTC组织及癌旁组织中Mt-P28、Mt-P43的表达情况。结果 甲状腺癌组Mt-P28平均灰度值(0.77±0.34)明显高于癌旁组(0.31±0.18)；Mt-P43平均灰度值(0.85±0.21)明显高于癌旁组(0.34±0.15)，差异均具有统计学意义(P<0.05)；Mt-P28表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期无关(P>0.05)；Mt-P43表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无关(P>0.05)而与临床分期有关(P<0.05)。Mt-P28与Mt-P43两者表达水平不具有相关性(r=0.266，P=0.071)。结论 Mt-P28、Mt-P43表达水平的升高倾向于病变恶性程度更高，对预测PTC不良预后有一定的临床应用价值，两种因子对于PTC的预防和治疗有指导意义。

甲状腺乳头状癌；Mt-P28；Mt-P43；RT-PCR

近年流行病学调查显示甲状腺癌发病率越来越高[1]，据加拿大癌症统计数据显示自2002年以来加拿大女性中，甲状腺癌以每年7%的速度稳定增长[2]。2012年中国卫生部统计报告[3]显示我国甲状腺癌发病率已上升至女性恶性肿瘤的第三位。文献报道[4]甲状腺激素受体(Thyroid hormone receptors，TR)在甲状腺良恶性肿瘤中表达不同，TR有TRɑ(c-erbAɑ)和TRβ(c-erbAβ)两种亚型，这两种亚型又可分为多种异形体，TRɑ1是甲状腺激素受体TR的一种主要的异形体。前期研究[4]发现线粒体内就存在甲状腺激素受体(Mitochondrial thyroid hormone receptor，Mt-TR)，包括P28及P43，甲状腺激素是通过Mt-TR对线粒体具有直接调节作用。Mt-P28及Mt-P43由TRɑ1转录后生成，Mt-P28存在于线粒体内膜上，在甲状腺激素作用下可直接激活线粒体的有氧呼吸。Mt-P43存在于线粒体基质中，线粒体过氧化物酶增殖体激活受体和线粒体维甲酸X受体作为辅助蛋白可分别与P43形成异二聚体，与线粒体三碘甲状腺原氨酸(T3)反应元件结合，参与甲状腺激素对线粒体的基因转录和线粒体生成等的调节[6]。为此研究人类甲状腺癌中Mt-P28和Mt-P43的表达情况及其临床病理的关系对于预防及治疗甲状腺恶性肿瘤具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取31例甲状腺乳头状癌的新鲜组织标本，手术标本取自于新疆医科大学第五附属医院2013—2015年间手术切除并经常规病理诊断证实的甲状腺乳头状癌及其癌旁组织(距癌组织>10 mm)。所有临床资料均完整，其中男性9例，女性22例，年龄22～69岁，平均45.7岁。本研究通过新疆医科大学第五附属医院伦理审查委员会批准及所有标本均获得患者的知情同意。

1.2 材料

凝胶成像分析系统(北京六一生产厂)、TRNzoI Universal Reagent、琼脂糖生物试剂、GOIdenViewTM、6×DNA loading Buffer、Marker I均购自北京天根生化科技有限公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)均购自德国罗氏生物有限公司；Mt-P28 mRNA及Mt-P43 mRNA转录水平检测均采用新鲜标本，RT-PCR检测。引物设计(表1)。

表1 引物Mt-P28、Mt-P43、β-actin的碱基序列

1.3 方法

方法按照Roche公司使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行总RNA反转录，步骤如下：(1)dT，1 μL；(2)Reaction Buffer，4 μL；(3)Rnase Inhibitor，0.5 μL；(4)dNTP，2 μL；(5)RT，0.5 μL；(6)Total RNA，500 ng。加ddH2O补到总体积为20 μL，轻轻混匀，离心15 s，置于PCR仪中，反应条件如下：(1)55℃ 30 min，1个循环；(2)85℃ 5 min，1个循环；(3)反应后产物置于﹣20℃保存。使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)进行RT-PCR；置于实时PCR仪中，将收集纯化后的DNA样品进行定量，按照8倍梯度稀释的方法，稀释成8支管，每管各取2 μL DNA作为模板，以Mt-P28、Mt-P43及β-actin为引物进行实时荧光定量PCR，反应体系和反应条件如下：(1)2×Taq PCR MasterMix，6 μL；(2)上游引物，1 μL；(3)下游引物，1 μL；(4)cDNA模板，2 μL。将以上物质轻轻混匀后加入ddH2O补到20 μL后放入200 μL PCR管中，离心20 s，置于普通PCR仪器中，反应条件为：(1)95℃ 10 min，1个循环；(2)60℃ 30 s，39个循环；(3)反应后产物置于4℃保存。

1.4 结果判定

采用紫外透射分析仪扫描各条带的光密度，以Mt-P28及Mt-P43的光密度值与β-actin基因的光密度值之比为相互间进行比较的参数。以癌旁正常组织参数的平均值为标准，≥平均范围为此基因表达升高，<正常范围为基因表达下降，未出现条带为基因缺失。用去离子水做为阴性对照。使用Quantity-One软件，计算各个样本Mt-P28及Mt-P43表达水平，表达量的相对值=目的扩增条带的灰度值/β-actin基因扩增条带的灰度值。

1.5 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析，根据所整理的实验结果数据情况对计量资料进行配对t检验；对临床病理因素间的关系进行Fisher精确检验；对两因子采用Spearman等级相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 31例甲状腺癌Mt-P28、Mt-P43在甲状腺癌组和癌旁组的表达情况

采用Image J软件对各条带进行灰度检测，31

例甲状腺癌组Mt-P28平均灰度值(0.77±0.34)明显高于癌旁组(0.31±0.18)，差异具有统计学意义(P<0.05)。Mt-P43平均灰度值(0.85±0.21)明显高于癌旁组(0.34±0.15)，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1)。

图1 Mt-P28、Mt-P43凝胶电泳图Figure 1 Electrophoresis of Mt-P28 and Mt-P43Note：lane 1 is the Maker；A.Thyroid tissue adjacent to carcinoma；B.Thyroid carcinoma tissue.

2.2 Mt-P28表达水平与临床病理间的关系

Mt-P28表达水平与甲状腺癌的性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期无关(P>0.05)(表2)。

表2 Mt-P28表达水平与临床病理间的关系

2.3 Mt-P43表达水平与临床病理间的关系

Mt-P43表达水平与甲状腺癌的性别、年龄、肿瘤大小及淋巴结转移无关(P>0.05)；与甲状腺癌的临床病理分期有关(P<0.05)(表3)。

表3 Mt-P43表达水平与临床病理间的关系

2.4 31例甲状腺癌中Mt-P28与Mt-P43的Spearman分析

使用Spearman等级相关检验，对PTC组织中Mt-P28与Mt-P43表达水平进行相关性分析，发现Mt-P28与Mt-P43表达水平两者不相关(r=0.266，P=0.071)(表4)。

表4 31例甲状腺癌组织中Mt-P28与Mt-P43的线性关系

3 讨论

近年来甲状腺疾病呈现上升趋势，文献显示[7]全球超过十分之一的人口可能因甲状腺结节(Thyroid nodule，TN)受到不同程度的困扰。在所有的TN中约4.5%～5.0%为恶性TN[8]，因此甲状腺癌患者基数庞大，为此寻找治疗甲状腺癌的临床治疗靶点尤为重要。实验发现[9]人体各组织中不同亚型的TR均有广泛表达，但不同的亚型在不同的组织中存在差异。TRɑ的主要功能是调节机体的生长、发育及新陈代谢，并维持甲状腺功能的正常。其中TRα1起主要作用。1995年Wrutniak等[10]研究发现甲状腺激素受体TRα1转录后的两个小截断片存在于线粒体中，其分子量分别为43 KDa(P43)和28 KDa(P28)，统称为线粒体甲状腺激素受体。

Mt-P28与T3核受体TRα1相比分子链稍短[11]，是因为P28是从mRNA链上第442个核苷酸开始翻译的，因此与TRα1相比，P28缺少A/B区和DNA结合域，但其对核受体T3的亲和力却更强。本实验结果表明Mt-P28 mRNA在甲状腺癌任何组织中均有表达，但在癌组织中表达水平明显升高。并与甲状腺癌的淋巴结转移和临床分期关系密切。但目前对于Mt-P28在甲状腺癌发生、发展中的具体功能尚不清楚。多数研究[12-14]只是初步印证Mt-P28在人类多种肿瘤中亦呈高表达状态，且其表达程度与患者临床分期及淋巴结转移呈正相关，尽管我们的实验未能与前期研究结果保持高度一致，但考虑到本实验研究样本量太少，结果出现一定偏差也在合理范围内，有待后续加大样本量来进行深入研究。

Mt-P43也是一种广泛表达的线粒体T3受体[4]，但其在核内未被检出，其与T3的结合力不亚于核受体TRα1，但要弱于Mt-P28。原因在于Mt-P43有DNA结合域和配体结合域，与TRα1相比只缺乏A/B区。Chocron等[15]研究发现线粒体甲状腺素受体(Mt-P43)能调高线粒体转录和线粒体生物合成。Casas等[16]报道Mt-P43是一个强有力的T3依赖性线粒体基因转录因子，其在T3存在下可迅速激活线粒体RNA多聚酶，进而激活线粒体基因的早期转录，使线粒体RNAs水平增加，线粒体相应蛋白合成增加，从而促进线粒体生成。本研究也表明Mt-P43在甲状腺癌组织中比癌旁组织表达水平明显升高，且与甲状腺癌的临床分期和淋巴结转移有关，可能揭示MT-P43表达增强的组织代谢相对活跃，导致生物学恶性度增高。

本研究在对Mt-P28和Mt-P43做进一步统计分析发现，两者之间并不具有相关性，但考虑到目前对两者在甲状腺癌发生中的具体功能机制并不清楚，所以并不能排除两者之间没有任何关联。由于本研究样本总数较少，对于两者之间的相互关系还需大样本研究进行深入探讨。

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3 王卓颖，吴毅.分化型甲状腺癌的诊治指南解读[J].外科理论与实践，2014，19(3)：185-188.

4 李仕亮，邵国安，王海超，等.TRɑ1蛋白在甲状腺良恶性肿瘤中的表达及临床意义[J].新疆医科大学学报，2016，39(5)：603-606.

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6 Martínez L，Nascimento AS，Nunes FM，et al.Gaining ligand selectivity in thyroid hormone receptors via entropy[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(49)：20717-20722.

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10 Wrutniak C，Cassar-Malek I，Marchal S，et al.A 43-kDa protein related to c-Erb A alpha 1 is located in the mitochondrial matrix of rat liver[J].J Biol Chem，1995，270(27)：16347-16354.

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14 Ulivieri C.Cell death：insights into the ultrastructure of mitochondria[J].Tissue Cell，2010，42(6)：339-347.

15 Chocron ES，Sayre NL，Holstein D，et al.The trifunctional protein mediates thyroid hormone receptor-dependent stimulation of mitochondria metabolism[J].Mol Endocrinol，2012，26(7)：1117-1128.

16 Casas F，Rochard P，Rodier A，et al.A variant form of the nuclear triiodothyronine receptor c-ErbAalpha1 plays a direct role in regulation of mitochondrial RNA synthesis[J].Mol Cell Biol，1999，19(12)：7913-7924.

(收稿：2016-12-10)

Expression and clinical significance of small fragments of P28 and P43 in papillary thyroid carcinoma after TRa1 gene transcription

LIShiliang1，XULei2，SHAOGuoan2，SUNFenfen3，SUNLinyong4，XUEJun5

1.Department of Thyroid and Breast Surgery，The Panzhihua General Hospital of Panzhihua Iron and Steel Group，Panzhihua 617000，China；2.Department of Thyroid and Breast Surgery，The Fifth Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University；3.Department of Kidney Internal Medicine，The Panzhihua General Hospital of Panzhihua Iron and Steel Group；4.Department of Pathology，The West China Hospital；5.Department of Pathology，The Linfen people′s Hospital

Objective The objective of this study was to investigate the expression of P28 and P43 in papillary thyroid carcinoma(PTC)and its relationship with clinicopathological features after TRa1 gene transcription.Methods Real-time fluorescence quantitative PCR(RT-PCR)and gel electrophoresis were used to determine the target fragments and to isolate the bands of different fragments.The optical density of each band was scanned by UV transmittance analyzer to detect 31 cases of PTC tissue and expression levels of P28 and P43 in para-cancerous tissues.Results The average gray value of P28 in thyroid carcinoma group was 0.77±0.34，which was significantly higher than that in para-cancer group(0.31±0.18).The average gray value of P43(0.85+0.21)in thyroid carcinoma group was significantly higher than that in para-cancer group(0.34±0.15)(P<0.05).The expression levels of P28 were not correlated with gender，age，tumor size，lymph node metastasis and clinical pathologic stage(P>0.05)，The expression levels of P43 were not correlated with gender，age，tumor size and lymph node metastasis.(P>0.05)but they were related to clinical pathologic stage(P<0.05).There was no correlation between expression levels of P28 and P43(r=0.266，P=0.071).Conclusion The increased expression of P28 and P43 may have a high degree of malignancy and a certain clinical value in predicting the adverse prognosis of PTC.Both factors are helpful for the prevention and treatment of PTC.

Papillary thyroid carcinoma；P28；P43；RT-PCR

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2012221A050)

1.攀枝花攀钢集团总医院甲状腺乳腺外科(攀枝花 617000)；2.新疆医科大学第五附属医院甲状腺乳腺外科； 3.攀枝花攀钢集团总医院肾内科；4.华西医院病理科；5.临汾市人民医院病理科

李仕亮，男，(1987-)，硕士，住院医师，从事肿瘤基础与临床的研究。

李仕亮，E-mail：1002679824@qq.com

R736.1

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.002