高同型半胱氨酸血症引起小鼠嗅球细胞损伤的初步探讨

张竞文 燕茹 常越 秦璟

高同型半胱氨酸血症引起小鼠嗅球细胞损伤的初步探讨

张竞文1燕茹2常越1秦璟3

目的 探讨高同型半胱氨酸血症损伤神经细胞的特点。方法通过高蛋氨酸饮食在ApoE-/-小鼠诱发高同型半胱氨酸血症，采用组织学，组织化学，免疫组化和原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）标记法（TUNEL），对比观察小鼠嗅球组织结构、尼氏体变化和细胞凋亡。结果 实验组血浆总同型半胱氨酸[（23．71±6．30）μmol/L]高于对照组[（6．47±2．66）μmol/L ]（P＜0．05）。在对照组和实验组，均可见嗅球的基本组织结构，实验组嗅球组织结构未见明显的异常。Nissl体染色可见，实验组Nissl体光密度值明显低于对照组（P＜0．05）。 NeuN免疫组织化学染色显示，实验组NeuN阳性神经元数量与对照组差异无统计学意义（P＞0．05）。实验组嗅球中TUNEL阳性颗粒细胞数量明显多于对照组（P＜0．05）。 结论 高同型半胱氨酸血症能够导致ApoE-/-小鼠嗅球神经元线粒体损伤和细胞凋亡。

嗅球；细胞凋亡；Nissl体；小鼠；高同型半胱氨酸血症

高同型半胱氨酸血症 （hyperhomocysteinemia，HHcy）是临床上常见的代谢异常之一，与多种人类疾病有关，是心脑血管疾病独立的危险因素，与Alzheimer病，Parkinson病，脑萎缩以及其他神经变性疾病有密切关系[1-2]。同型半胱氨酸所致中枢神经系统损害和疾病的作用及其机制尚不清楚。研究提示，同型半胱氨酸可作为兴奋性氨基酸，增加神经元对外源性有害物质和氧化损伤的敏感性，从而加重或促进损伤的发生[1，3]。嗅球（Olfactory bulb）是哺乳动物大脑的一部分，作为大脑中一个非常重要的感觉系统[4]，在许多疾病，特别是中枢神经疾病初期就可发生神经元损伤[4]。研究提示，嗅觉功能障碍的发生通常早于认知障碍[4-5]。但是，作为单独的致病因素，HHcy所致的中枢神经系统损伤尚缺少组织学的证据；关于HHcy对嗅球神经元结构和细胞凋亡的影响尚不清楚。本研究采用经典的方法[1，2，6]，通过饲喂高蛋氨酸饮食，在ApoE-/-小鼠诱导HHcy，采用组织学，组织化学，免疫组织化学和原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）标记法（TUNEL）技术，对比观察HHcy所致嗅球神经元损伤及其细胞凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级近交系C57BL/6J背景5周龄雄性纯合子ApoE-/-小鼠20只，体重为18～20 g（购自美国杰克逊实验室），AIN-93G饲料（上海萨博生物有限公司），含1.7%蛋氨酸的AIN-93G饲料（上海萨博生物有限公司）。 抗 神 经 元 核 抗 原 （neuronal nuclei，NeuN） 抗体（Abcam 公司），HRP标记的兔二抗IgG（Invitrogen公司），TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（罗氏公司），DAB显色试剂盒，PBS缓冲液等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理

ApoE-/-小鼠20只，适应性喂养1周。按照随机化原则分为2组，每组10只：（1）正常饮食 ApoE-/-对照组（简称对照组），饲以普通AIN-93G饲料；（2） 高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症实验组（简称实验组），饲以添加1.7%蛋氨酸的AIN-93G饲料；所有动物均在相同条件下按分组的饮食喂养18周，室温（22±1）℃，湿度 40%～70%，12 h 光照/12 h 黑暗，自由采食和饮水。

1.2.2 标本制备 高蛋氨酸饮食喂养18周，3.5%水合氯醛，0.1 ml/10 g麻醉小鼠，收集血液置于抗凝EP管，4℃冷藏。包括嗅球的脑组织沿矢状切面一分为二，4%多聚甲醛固定。

1.2.3 血浆同型半胱氨酸水平测定 血液在室温静置30 min，离心（4℃，3 000 r/min）10 min后，分离上层血浆，装入EP管。用ADVIA 2400全自动生化仪检测血浆同型半胱氨酸浓度（μmol/L）。

1.2.4 尼氏染色 石蜡切片常规脱蜡脱水；亚甲蓝10 min；分化液2 min；钼酸铵溶液5 min，蒸馏水冲洗；常规脱水透明，中性树胶封片。光学显微镜观察，在高倍镜（400X）下采图，采用图像分析软件测定平均光密度值。

1.2.5 TUNEL 应用 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞，根据说明书进行实验操作。在光学显微镜下观察，高倍镜下采图，计数高倍镜下TUNEL阳性的细胞数量，计算出每高倍镜下TUNEL阳性细胞比例：TUNEL阳性细胞/TUNEL阳性细胞+TUNEL阴性细胞。

1.2.6 免疫组织化学染色 切片脱蜡水化，蒸馏水冲洗；高压锅抗原修复； 3%双氧水室温30 min，用PBS冲洗3次；山羊血清封闭，室温30 min；NeuN一抗（1：200），湿盒4℃过夜；二抗37℃孵育1 h；用DAB显色1 min； 苏木素复染，中性树脂胶封片。光学显微镜观察，高倍镜下采图，采用图像分析软件计数高倍镜下NeuN阳性的细胞数量，计算出每高倍镜视野下NeuN阳性细胞数，并进行统计学处理。

1.2.7 统计学处理 采用 SPSS 20.0 统计软件进行独立样本检验，计量资料数据以（均数±标准差）表示，组间比较进行t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆同型半胱氨酸

对照组血浆总同型半胱氨酸为（6.47±2.66）μmol/L，实验组为（23.71±6.30）μmol/L，实验组血浆同型半胱氨酸含量明显增加，与对照组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 血浆同型半胱氨酸测定结果

2.2 嗅球组织学

在对照组和实验组，均可见基本的嗅球组织结构，嗅神经层，突触球层，外丛状层，僧帽细胞层，内丛状层，颗粒细胞层清晰可见。与对照组比较，在实验组未见明显的细胞层次紊乱、脑水肿、坏死等结构异常或病理变化（图2）。

2.3 Nissl体

通过尼氏染色可见，在颗粒细胞层、僧帽神经元、嗅小球神经元均可见比较丰富的Nissl体（图3）。光密度值分析可见，实验组Nissl体光密度值低于对照组（P＜0.05） （图4）。

2.4 NeuN免疫组织化学

图2 嗅球组织学

图3 嗅球Nissl体染色结果

图4 嗅球Nissl体染色光密度值统计结果

在对照组，僧帽神经元、嗅小球神经元、大多数颗粒层细胞NeuN阳性，阳性强度为棕黄色，着色强度基本一致，定位于细胞核。实验组NeuN阳性情况与对照组接近，未见明显的NeuN阳性细胞减少。对NeuN阳性颗粒细胞进行计数统计可见，实验组NeuN阳性神经元与对照组差异无统计学意义（P＞0.05） （图 5）。

图5 嗅球NeuN阳性细胞统计结果

2.5 细胞凋亡

在对照组，小鼠嗅球颗粒细胞层中散在少数TUNEL 阳性细胞，实验组TUNEL阳性细胞明显增加（图6）。对TUNEL阳性颗粒细胞进行计数统计可见，实验组TUNEL阳性颗粒细胞多于对照组（P＜0.05）（图7）。

图6 嗅球TUNEL染色结果

3 讨论

图7 嗅球TUNEL染色阳性细胞统计结果

嗅球是大多数哺乳动物（包括人类）中枢神经系统的重要组成部分，在有害因素存在时，嗅球受到损伤的时间常常早于其他部分的脑组织[6]。有研究提示，嗅觉功能障碍可以作为早期诊断神经变性疾病的重要指标，也是判断其进展的重要依据[6-7]。流行病学和临床研究提示，高同型半胱氨酸血症（HHcy）与Alzheimer病，Parkinson病，脑萎缩以癫痫等有关[1，8]。本研究结果显示，在高蛋氨酸食物饲喂的ApoE-/-小鼠，能够引起中度HHcy，嗅球的组织学结构存在，在光学显微镜下未见明显的病理变化；从反映线粒体结构的Nissl体可见，实验组Nissl体染色光密度值明显低于对照组；同时，实验组TUNEL阳性细胞明显增加。结果提示，HHcy能够导致ApoE-/-小鼠嗅球神经细胞线粒体损伤和凋亡增加。

目前，关于HHcy所致中枢神经系统损伤及其机制仍然不清楚。本研究结果显示，HHcy组嗅球颗粒细胞TUNEL阳性细胞明显增加。提示HHcy可能诱导小鼠嗅球神经细胞的凋亡，从而影响嗅球神经元的更新和功能。有研究提示，同型半胱氨酸可作为兴奋性氨基酸，增加神经元对外源性有害物质损伤的敏感性[6-7]。HHcy能够加重细胞对氧化损伤的敏感性，并诱发兴奋性毒性[3，7]。研究提示，SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系培养基加高同型半胱氨酸培养5天后，ROS产物增加4.4倍，随着培养时间延长可产生基因毒性，引起DNA断裂[3]。HHcy诱导的细胞损伤与谷氨酸受体亚型以及NMDA激活有关，也与DNA损伤、P53激活以及线粒体功能障碍有关[1，3，9]。

本研究通过高蛋氨酸饮食在ApoE-/-小鼠诱发了高同型半胱氨酸血症。在实验组，嗅球未见明显的组织学异常；组织化学检查可见，实验组Nissl体染色光密度值明显低于对照组；实验组嗅球TUNEL阳性细胞明显增加，原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸能够标记出凋亡细胞。结果提示，高同型半胱氨酸血症能够导致ApoE-/-小鼠嗅球神经细胞线粒体损伤和凋亡增加，这可能与高同型半胱氨酸所致的神经细胞损伤有关[10-11]。由于体内同型半胱氨酸代谢复杂，其产生和排泄处于动态平衡过程中，高同型半胱氨酸诱导的中枢神经系统病理损害具有十分复杂的过程和机制[6，12]。因此，要了解高同型半胱氨酸对神经细胞的损伤及其机制尚需更多更深入的研究。

[1] Aléssio AC，Santos CX，Debbas V，et al． Evaluation of mild hyperhomocysteinemia during the development of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient and normal mice[J]． Exp Mol Pathol，2011，90（1）：45-50．

[2] 姜怡邓，杨安宁，王菊，等． 高同型半胱氨酸血症对ApoE-/-鼠心肌酶谱的影响及与P53基因的相关性分析[J]． 中国动脉硬化杂志，2013，21（1）：16-21．

[3] Currò M，Trovato-Salinaro A，Gugliandolo A，et al． Resveratrol protects against homocysteine-induced cell damage via cell stress response in neuroblastoma cells[J]． J Neurosci Res，2015，93（1）：149-156．

[4] Schppa NE，Urban NN． Dendritic processing within olfactory bulb circuits[J]． Trends Neurosci，2003，26（9）：501-506．

[5] Fletcher ML，Masurkar AV，Xing J，et al． Optical imaging of postsynaptic odor representation in the glomerular layer of the mouse olfactory bulb[J]． J Neurophysiol，2009，102（2）：817-830．

[6] 勉睿清，高明，蔡文元，等． UCP2基因敲除小鼠在高血糖加重脑缺血损伤模型中的应用[J]． 中国卫生标准管理，2015，6（15）：200-202．

[7] Lledo PM，Merkle FT，Alvarez-Buylla A． Origin and function of olfactory bulb interneuron diversity[J]． Trends Neurosci，2008，31（8）：392-400．

[8] Parrish AS，SHipley MT，Erdelyi F，et al． Quantitative analysis of neuronal diversity in the mouse olfactory bulb[J]． J Comp Neurol，2007，501（6）：825-836．

[9] Kamat PK，Kyles P，Kalani A，et al． Hydrogen sulfide ameliorates homocysteine-induced Alzheimer's disease-like pathology，bloodbrain barrier disruption，and synaptic disorder[J]． Mol Neurobiol，2016，53（4）：2451-2467．

[10] 韩飞，杨静，余文富，等． GAD67-GFP 基因敲入小鼠GFP与nNOS在嗅球中的表达和共存研究[J]． 浙江大学学报（医学版），2012，41（2）：159-165，170．

[11] 王磊，田珏，曹成建，等． 高同型半胱氨酸血症经内质网途径影响ApoE-/-鼠肝细胞凋亡[J]． 中国药理学通报，2014，30（2）：261-265．

[12] 邓鹏飞，李递通． 高同型半胱氨酸血症与神经疾病关系的研究进展[J]． 中国医学创新，2016，13（8）：145-148．

Preliminary Study on the Injury of Olfactory Bulb Cells Induced by Hyperhomocysteinemia in Mice

ZHANG Jingwen1YAN Ru2CHANG Yue1QIN Jing3
1 School of Basic Medical Science, Ningxia Medical University, Yinchuan Ningxia 750004, China; 2 Cardiac Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan Ningxia 750004, China; 3 Pathology Department, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan Ningxia 750004, China

ObjectiveTo investigate the characteristics of neuronal cell damage induced by hyperhomocysteinemia (HHcy).MethodsHyperhomocysteinemia was induce by a high-methionine diet in ApoE-/-mice. The histology, Nissl body and apoptosis in the olfactory bulb were comparatively studied by histology, histochemistry, immunohistochemistry and terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL).ResultsThe total plasma homocysteine in the experimental HHcy group [(23.71±6.30) μmol/L] was significantly higher than that in the control group [(6.47±2.66) μmol/L ](P ＜ 0.05). In the control group and experimental HHcy group, the basic structure of olfactory bulb was observed, and there were no obvious histological abnormalities in the experimental HHcy group. Nissl body staining showed that the optical density of Nissl bodies in the experimental HHcy group was significantly lower than that in the control group (P ＜ 0.05). As was immunohistochemistry showed that no signi ficant difference between the numbers of NeuN-positive neuron between the experimental HHcy group and the control group (P ＞ 0.05). The numbers of TUNEL-positive granule cells in the experimental HHcy group were significantly higher than those in the control group (P ＜0.05).ConclusionThe hyperhomocysteinemia may be able to induce mitochondrial damage and apoptosis in olfactory bulb neurons of ApoE-/-mice.

olfactory bulb; apoptosis; Nissl body; mice; hyperhomocysteinemia

R589

A

1674-9316（2017）17-0127-05

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．17．068

宁夏医科大学优势学科群研究项目（XY201714）

1宁夏医科大学基础医学院，宁夏 银川 750004；2宁夏医科大学总医院心脏中心，宁夏 银川 750004；3 宁夏医科大学总医院病理科，宁夏 银川 750004