基于MDCK悬浮细胞生产禽流感疫苗的放大工艺开发

代为俊，刘旭平，周燕

(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

基于MDCK悬浮细胞生产禽流感疫苗的放大工艺开发

代为俊，刘旭平，周燕

(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

为放大流感疫苗生产工艺至1500 L反应器规模，通过冷模实验研究了不同体积反应器条件下的混合时间、流体剪切力、体积氧传递系数和二氧化碳传递系数的区别。在1500 L反应器中进行培养时，转速为60 r/min，深层通气速率控制在22.5 L/min能够较好的满足供氧需求和提高CO2的移除效果，同时也避免了剪切力对细胞的损伤。在1500 L反应器中病毒感染细胞60 h后，病毒滴度为211HA units/25 μL，单位细胞病毒产量(Svy)为13145.05 virions/cell，2 L反应器的Svy为13298.70 virions/cell，两者仅相差1.16%。

流感疫苗；MDCK细胞；生物反应器；冷模实验；放大

传统的流感疫苗是基于鸡胚工艺生产，然而由于其成本高、产量有限、生产周期长等缺点，已慢慢被淘汰[1]。近年来，基于动物细胞培养的生产工艺已经可以取代鸡胚培养工艺，并逐渐成为生产流感疫苗最主要的主流技术。一些欧美国家，已经批准基于动物细胞培养生产的流感疫苗上市[2-4]。MDCK细胞最适于生产甲型流感病毒和乙型流感病毒的三种细胞之一[5-6]，可以生产安全有效的人用和兽用疫苗，具有很高的产毒能力。而随着病毒类疫苗的市场需求量的不断扩大，产能不足使得动物细胞大规模高密度培养显得更为重要。在摇瓶到大型生物反应器的放大过程中，混合和气液传质是最关键的问题。与微生物发酵不同，动物细胞培养既涉及O2的供应速率，又涉及过量CO2积累后的移除速率。O2和CO2传递表现出不同的特征，但两者又都受搅拌转速、深层通气速率、温度、装液量、气泡直径的影响，且在不同尺寸反应器内表现出不同的特征。因此，有必要对其进行详细的研究，通过揭示两者的气液传质规律，指导生物反应器内氧供应和二氧化碳移除策略及生物反应器的放大。

本文通过冷模实验对反应器内部流体混合、流体剪切和气液传质特性进行考察，在此基础上选取关键放大参数，将2 L反应器细胞培养和接毒工艺放大至1500 L规模，并将两者最后的血凝值(HA)和单细胞病毒产量Svy相比较，为流感疫苗工艺放大提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 细胞株、培养基和病毒株 实验所用细胞株为本实验室对贴壁型MDCK细胞进行驯化得到的悬浮型MDCK细胞株。培养基为Driving-M MDCK细胞无血清培养基，购自上海倍谙基生物科技有限公司。病毒株为H9亚型禽流感病毒株，由肇庆大华农生物药品有限公司提供，实验环境为P2实验室。

1.2 冷模实验材料 1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液。测试培养基：LB培养基。

1.3 冷模实验测定方法

1.3.1 混合时间测定方法 反应器内混合特性常用混合时间tmix表征，即反应器内流体混合均匀性达到95%所需的时间[7]。将LB培养基加入到反应器内，控制一定条件。在反应器的顶部和底部对角位置分别装上一个pH电极，稳定时记录初始值pHi。

本实验从反应器的上端(远离pH电极)迅速加入V0体积的示踪剂(1 mol/L NaOH，V0<0.5%V)，分别记录反应器上下pH随时间的变化。pH电极记录下的原始数据用公式(1)进行归一化处理，其中H(t)为标准化pH，pH(t)为实时pH，pHi为初始pH值，pHf为最终pH。当反应器内的流体完全混合均匀，则稳定后的H(t)值为1.0。实际上，当H(t)=1.0±0.5时，即可认为混合均一。

t1、t2分别表示上下两个电极测得混合均匀度达95%时所需的时间，混合时间tmix可表示

tmix=(t1+t2)/2 (2)

在反应器内加入等量1 mol HCl，调整测试培养至初始状态；重复实验。

按照上述方法，分别测定不同操作条件下的tmix。

1.3.2 体积氧传质系数(kLa)的测定[7-8]校正溶氧电极。将测试培养基加入到反应器内，设置一定操作参数。底层通氮气，排净培养基中的氧气(实际只需DO<10%即可)。转换到深层通气为空气，记录不同时刻的DO，直至DO>60%后结束实验，绘制DO-t(10%≤DO≤60%)曲线。通过以下公式计算气液传质系数kLa：

积分，得

其中，C0为初始氧浓度，Ct为t时刻的氧浓度，C*为饱和氧浓度。

利用对t做曲线，斜率即为kLa。

1.3.3 剪切力，涡流尺寸，叶端速率的计算 剪切力和涡流尺寸的计算公式如下[9]：

τk=ρL(εv)1/2，τik=ρL(εiv)1/2(6)

η=(v3/ε)1/4，ηi=(v3/εi)1/4(7)

当V=D3时，εi、τik和ηi分别为局部能量耗散率、局部剪切力和局部湍流尺寸。式中，ε为单位体积内的能量耗散率(W/kg)，V为反应器中的液体体积(m3)，ρL为液体密度(kg/m3)，NP为功率准数，N为转速(s-1)，D为搅拌桨直径(m)，ν为流体的运动粘度(m2/s)。

UT=πND(8)

其中，UT为叶端速率，N为转速。

1.3.4 CO2传质系数的测定[7-8]先通CO2至反应器内pCO2>150 mmHg。改通空气并开始计时。记录pCO2随时间的变化曲线。直到pCO2<100 mmHg停止实验。

CO2气液传质系数的计算方法与O2相似，公式为：

其中，C*为饱和二氧化碳浓度。

1.4 细胞培养

1.4.1 种子细胞复苏 取出液氮罐中冻存的悬浮MDCK种子细胞，置于37 ℃水浴槽中快速孵化，离心弃上清，使用新鲜无血清培养进行细胞重悬，以0.8×106～1.0×106cells/mL的密度在125 mL的摇瓶内复苏。每隔48 h，使用新鲜培养基以1︰3～1︰4(V/V)比例进行稀释传代。

1.4.2 2 L反应器种子培养 取对数生长期的全悬浮MDCK细胞，以2.0×106cells/mL的活细胞密度接种至反应器，培养体积为2 L。反应器操作如下，pH为7.0，DO为40%空气饱和度，温度为37 ℃，搅拌转速为120 r/min。当密度达到8.0×106cells/mL时，种子细胞悬液以1∶3～1∶4(V/V)比例稀释，放大到下一级种子细胞反应器中。30 L反应器种子由2 L反应器提供，200 L反应器由30 L反应器提供，500 L反应器种子由200 L反应器提供，1500 L反应器种子由500 L反应器提供。

1.4.3 反应器接毒培养 当细胞培养至9.0×106～10.0×106cells/mL时，添加新鲜的Driving-M MDCK细胞无血清培养基，使细胞密度维持在6.0×106cells/mL，并且按照MOI=0.001接入病毒种子液进行培养。TPCK-胰酶终浓度为5 μg/mL。同时，反应器的参数也进行变化，温度为34 ℃，pH为7.2±0.2。培养过程中，每隔24 h取样计数，培养悬液经10000 r/min离心5 min后取上清于-20 ℃保存，用于病毒滴度检测。

1.5 病毒滴度测定 测定流感病毒血凝滴度(HA滴度)所用血凝板是“U”形底96微孔反应板自左至右各孔以微量移液器加入25 μL生理盐水；于左侧第1孔加25 μL病毒样品，混匀后吸25 μL至第2孔，依次2倍比系列稀释至第11孔，吸弃25 μL，第12孔为无病毒阴性对照；自右至左(防止窜孔)依次向各孔加入1.0% (V/V)鸡红细胞悬液(约5×107cells/mL)25 μL，振荡混匀，室温静置30 min左右后观察结果。

1.6 单位细胞产毒量的计算 单位细胞的产毒量(Svy)表征单个细胞的产毒能力[10]，通过以下公式计算：

其中，RBC是鸡红细胞的密度(RBC/mL)，HA是病毒的血凝值(HA units/25 μL)，Xv是活细胞密度(106cells/mL)。

2 结果与分析

2.1 生物反应器中流体的混合时间 26.7 ℃ 50 r/min条件下1500 L反应器的混合时间如图1所示。从中可以看出当碱加入反应器时，顶部的pH会有一个突跃，随后下降，而底部的pH反应较慢但一直持续上升，直至达到均匀。顶部与底部的混合时间差异明显，顶部的混合时间为32 s，底部的为63 s。

图1 1500 L反应器中混合时间测定曲线Fig 1 Representative normalized pH(H) response curves from the top and bottom probes in 1500 L bioreacter during the mixing time experiment

根据式(2)可知，在该条件下混合时间为47.5 s。同理测定了不同转速下的混合时间，其结果如下表1，可以发现顶部的混合时间都小于底部的混合时间随着搅拌转速的提高，单体体积输入功率(P/V)增加，加速流体的混合，混合时间变短。

表1 不同搅拌转速下顶部和底部混合时间差异Tab 1 Difference of top and bottom mixing time under different agitation speed

t1、t2分别表示上下两个电极测得混合均匀度达95%时所需的时间，混合时间tmix=(t1+t2)/2

2.2 生物反应器的流体剪切 随着搅拌转速的提高，反应器内流体剪切力τk增加，η涡流尺寸减小。研究报道，剪切力大于1 N/m2就会对细胞造成损伤，而湍流尺寸接近或者小于细胞直径时，将会对细胞产生损伤[11]。因此，通过提高搅拌转速对混合效果进行改善，还要考虑流体剪切力和涡流尺寸分布。

通过计算，得到200 L、500 L和1500 L反应器内局部剪切力和湍流尺寸的分布如图2所示。随着搅拌转速的提高，流体局部剪切力增大。当500 L和1500 L反应器的搅拌转速为100 r/min时，流体局部剪切力已经大于1 N/m2，继续提高搅拌转速可能对细胞造成损伤。而200 L反应器100 r/min条件下剪切力仍在细胞可承受的范围内，为0.749 N/m2。哺乳动物细胞直径一般在10～20 μm，当湍流尺寸接近20 μm时就有可能对细胞造成损伤[11]。本实验中200 L、500 L和1500 L反应器在搅拌转速为150 r/min时局部湍流尺寸均已经小于20 μm，因此，实际操作时搅拌转速不应超过150 r/min。

图2 搅拌转速对局部Kolmogorov剪切力和涡旋尺度的影响Fig 2 Influence of agitation speed on Kolmogorov shear stress and eddy size

此外，搅拌桨叶端速率对细胞的损伤作用也不可忽视。动物细胞能耐受的叶端速率一般不大于2 m/s[12]。由图3可知，2 L和30 L反应器内搅拌转速达到200 r/min时，UT均未超过细胞的耐受极限。但是200 L、500 L和1500 L反应器内搅拌转速分别在130 r/min、100 r/min和70 r/min时，UT已经接近2 m/s。这些搅拌转速可以作为反应器操作过程中设定的极限值，所以1500 L生物反应器内最大搅拌转速不能超过70 r/min。

图3 搅拌转速对搅拌桨叶端速率的影响Fig 3 Influence of agitation speed on impeller tip speed

2.3 深层通气和搅拌转速对体积氧传质速率的影响

从图4看出，随着深层通气的增加，kLa大致呈现下降趋势。这是由于实验所用的microsparager，通气量较大时，气泡发生聚并，反而减小了气泡的表面积，从而使得kLa减小。所以在选用microsparager作为鼓泡环的时候要选择合适的通气量。同时，随着搅拌转速的提高，传质系数不断增大。这主要是因为：①搅拌转速的提高加强了流体湍流特性，使液膜厚度变薄，从而减小了传质阻力，强化了传质；②对于深层通气而言，搅拌转速的提高还会延长气泡在反应器内的停留时间，从而增大了气液接触面积，起到了提高传质系数的作用。

图4 深层通气速率和搅拌转速对kLa的影响Fig 4 Influence of aeration rate and agitation speed on kLa

2.4 小泡在大型反应器对气液传质的影响 在1500 L生物反应器中固定搅拌转速为60 r/min，用microsparager进行深层通空气，研究深层通气速率对CO2的移除速率的影响，结果见图5。可以看出，通气速率从7.5 L/min增加到22.5 L/min，pCO2的移除速率随着增加，但是到30 L/min时pCO2移除速率反而降低。在20～60 r/min都出现这种现象。这是因为：①通气量增大，气泡在microsparager开孔处产生聚并现象导致速率的下降；②在1500 L反应器中液面高度接近2 m，从microsparager出来的气泡较小，在上升过程发生溶解导致速率的变慢。

图5 深层通气对二氧化碳移除速率的影响Fig 5 Influence of aeration rate on CO2 remove rate

通过式(9)计算得到了不同搅拌转速、不同深层通气量条件下kLaCO2，如图6所示。结果表明，深层通气对改善二氧化碳的移除效果不明显，当转速为30 r/min和通气速率为15 L/min时，kLaCO2最大为1.3 h-1。所以在用microsparager作为鼓泡环时并不是搅拌转速越大通气速率越快，二氧化碳的移除效果越好。

图6 搅拌转速通气速率对CO2移除速率的影响Fig 6 Influence of agitation speed and aeration speed on CO2 remove rate

2.5 反应器病毒增值结果 根据上述研究结果，在1500 L反应器中进行培养时，转速为60 r/min，深层通气速率控制在22.5 L/min，能够较好的满足供氧需求和提高CO2的移除效果，同时也降低了剪切力对细胞的损伤。

图7 2 L和1500 L反应器流感病毒增殖结果Fig 7 Influenza virus production between 2 L and 1500 L bioreactor

病毒感染细胞24 h、48 h和60 h后，病毒滴度分别为29、211和211HA units/25 μL；单位细胞的病毒产率Svy为13298.70 virions/cell，与2 L反应器单位细胞病毒产率仅相差1.16%(图7)。因此，可以认为2 L反应器接毒结果顺利放大到1500 L反应器，工艺从2 L实验室规模成功放大到1500 L规模。

3 结 论

混合与传质是细胞培养过程中的两大问题,是细胞培养过程中重要的环节，反应器的混合传质的效果直接影响细胞培养过程。本文通过冷模实验对1500 L反应器的混合和传质进行了测定，结果表明大罐中存在混合不均一现象，提高转速能加快液体的混合；随着反应器规模的增大，流体剪切力和叶端速度也随之增大，所以在细胞培养过程中要选择合适的搅拌转速；由于鼓泡环为microsparager，体积氧传递系数kLa在一定范围内随着深层通气速率的提高而增加，当深层通气速率较大时，kLa减小。同时，随着搅拌转速的提高，传质系数不断增大；深层通气速率和CO2移除速率的关系并不呈线性关系，在实际生产中需要具体考察，选取合理的深层通气速率，满足CO2移除要求。1500 L反应器最终HA为211HA units/25 μL，单位细胞的病毒产量为13298.70 virions/cell，与2 L反应器单位细胞病毒产率仅相差1.16%，基本重现2 L反应器接毒结果。

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(编辑：李文平)

Development of Scale up for the Production of Influenza Vaccine Based on MDCK Suspension Cells

DAI Wei-jun, LIU Xu-ping, ZHOU Yan

(State Key Laboratory of Bioreacter Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

LIU Xuping, E-mail: xupingliu@ecust.edu.cn

In order to scale up the flu vaccine production to 1500 L animal cell culture bioreactor, cold form experiment was carried out in 1500 L bioreactor, including mixing time, liquid shear force, volumetric oxygen transfer coefficient and volumetric carbon dioxide transfer coefficient. When cultured in a 1500 L bioreactor, agitation speed and aeration rate was 60 r/min, and 22.5 L/min, respectively, which could meet the oxygen requirement, improve the effect of CO2remove and reduce the shear force on cells. Virus-infected cells after 60 h in a 1500 L bioreactor, the virus titer was 211HA units/25 μL, the specific virus yield (Svy) was 13298.70 virions/cell, which is the difference of 1.16% in 2 L bioreactor.

influenza vaccine; MDCK cell; bioreactor; cold form experiment; scale up

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.08

代为俊，硕士研究生，从事动物细胞的培养研究。

刘旭平。E-mail: xupingliu@ecust.edu.cn

2017-02-17

A

1002-1280 (2017) 08-0046-06

S852.5