枳椇子对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞产生细胞因子表达的影响

姚侃男 冯彩珠 朱肖鸿

1 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江 杭州 310053 2 浙江省中医院 浙江 杭州 310018

中药研究

枳椇子对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞产生细胞因子表达的影响

姚侃男1冯彩珠1朱肖鸿2#

1 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江 杭州 310053 2 浙江省中医院 浙江 杭州 310018

枳椇子 RAW264.7巨噬细胞 脂多糖 TLR4

实验组在先期研究中已得到枳椇子可以减轻酒精灌胃大鼠炎症及脂肪变[1]。本文在先期研究基础上，探索枳椇子对LPS作用于RAW264.7巨噬细胞所产生的细胞因子的影响及其相关机制，明确枳椇子对肠源性内毒素血症的保护作用。

1 材料

1.1 药品与试剂：枳椇子颗粒剂购自江阴天江药业有限公司；LPS购自Sigma公司；RAW264.7；30%丙烯酰胺（29:1）、RIPA组织细胞快速裂解液、过硫酸铵、SDS、Tris购自Solarbio公司；BCA蛋白定量试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒购自Thermo公司；蛋白预染Marker、逆转录试剂盒购自Fermentas公司；Rabbit anti TLR4 Polyclonal antibody（96kD）、Rabbit anti p65（65kD）购自Proteintech公司；p-p65（65kD）购自Aff inity公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH）（37kD）购自CST公司；羊抗兔HRP标记二抗、驴抗山羊HRP标记二抗、羊抗鼠HRP标记二抗购自碧云天公司；NC膜、发光液购自Mi l lipore公司；PBS磷酸盐缓冲液购自上海长岛抗体诊断试剂公司；脱脂奶粉购自BD分装公司；Tween-20购自Amresco公司；Trizol购自Invit rogen公司；DEPC处理水购自基尔顿生物；异丙醇、无水乙醇、氯仿购自国药集团。

1.2 主要仪器：TG-16M型低温冷冻离心机购自上海卢湘离心机仪器有限公司；K30型涡旋振荡器购自青浦泸西仪器厂；ABI-7300型Real-time检测仪购自ABI公司；PRO200型电动匀浆仪购自FLUKO公司；mini protean 3 cel l型电泳仪购自BIO-RAD公司；PS-9型电转仪购自大连竞迈科技有限公司；MK3型酶标仪购自芬兰雷勃酶标仪；P型移液器购自吉尔森公司；HI1210型水浴锅购自Leica公司；Tanon-520型成像系统购自Tanon公司。

2 方法

2.1 细胞培养：RAW264.7用含10%胎牛血清，1%双抗(青链霉素混合液)的DMEM培养液，置于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，取对数期细胞用于实验。

2.2 Western Blot法检测RAW264.7巨噬细胞中TLR4、p-p65、p65蛋白含量：将处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化，显微镜下计数，按照每孔50万的密度铺入6孔板中，每组细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔。每块板设置4个组，处理24h后，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量法检测各组细胞蛋白浓度，PAGE凝胶电泳，转膜，膜上蛋白检测，5%脱脂奶粉室温封闭1h，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育1h，ECL显色。根据先期试验结果，枳椇子浓度取0.8mg/ml。分组见表1。2.3 qRT-PCR法检测RAW264.7巨噬细胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-βmRNA的表达：采用Trizol试剂提取总RNA，操作流程按试剂盒进行。根据基因序列设计PCR引物，具体见表2。合成cDNA第一条链，取2μLcDNA为模板，在25μL反应体系中进行r tPCR扩增，反应条件：95℃变性15s，60℃退火45s，循环40次。据采用仪器自带软件分析：ABI Prism 7300 SDS Sof tware。

表1 细胞分组

3 结果

3.1 枳椇子提取液对RAW264.7细胞中TLR4、p-p65、p65蛋白含量的影响：由图1及图2可知，相比空白对照组，LPS未处理时，枳椇子对TLR4、p-p65、p65蛋白含量无显著影响；而LPS处理后，单纯的LPS处理组TLR4、pp65含量增加，p65蛋白含量无显著变化；与单纯的LPS处理组相比，枳椇子处理组的TLR4、p-p65蛋白含量减少，p65蛋白含量无显著变化。

表2 引物序列

图1 Western blot检测TLR4、p-p65、p65条带图谱

图2 枳椇子提取液对巨噬细胞中TLR4、p-p65、p65蛋白含量的影响

3.2 枳椇子提取液对RAW264.7细胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA表达的影响：由图3可知，相比空白对照组，LPS未处理时，枳椇子对TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA表达无显著影响；而LPS处理后，单纯的LPS处理组上调TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表达，下调IL-10mRNA表达；与单纯的LPS处理组相比，枳椇子处理组的TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表达显著下调，上调IL-10mRNA表达。

图3 枳椇子对巨噬细胞组中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA表达的影响

4 讨论

本实验研究发现，经LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞增加TLR4、p-p65蛋白表达，上调促炎因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表达，抑炎因子IL-10的含量减少；枳椇子在0.8mg/ml时则可减少TLR4、p-p65含量及抑炎因子如TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表达显著下调，上调IL-10mRNA表达，其机制可能与枳椇子能调节抑炎因子与促炎因子的失衡状态相关。我们也可从中得出，枳椇子可调节肝内免疫，同时对改善肝脏炎症有明显确切的疗效。此后，我们也将进一步进行枳椇子相关的动物实验研究，为临床使用枳椇子治疗酒精相关性肝病提供依据。

[1]陈春晓,朱肖鸿.酒精性肝炎大鼠模型建立及枳椇子的干预作用[J].浙江中西医结合杂志,2007,17（5）：285-287.

2017-04-10

# 通讯作者：朱肖鸿，E-mai l：zxh922@sina.com