艾灸对兔膝骨性关节炎模型血清IL-1β、COX-2、COMP表达的影响

姚 畅 程 珂 赵 玲 沈雪勇

1 浙江中医药大学附属第三医院 浙江 杭州 310005 2 上海中医药大学针灸推拿学院 上海 201203

艾灸对兔膝骨性关节炎模型血清IL-1β、COX-2、COMP表达的影响

姚 畅1程 珂2赵 玲2沈雪勇2

1 浙江中医药大学附属第三医院 浙江 杭州 310005 2 上海中医药大学针灸推拿学院 上海 201203

艾灸 膝骨关节炎 IL-1β COX-2 COMP 兔

膝骨性关节炎是一种常见的中老年疾病，膝关节的疼痛和功能障碍严重影响了患者的生活。近年来，国内外对膝骨性关节炎的治疗进行了大量临床研究，报道的治疗手段包括休息、物理治疗、药物治疗、支具、运动疗法和手术等。目前临床常用非类固醇消炎止痛药（NSAID），通过这类药物抗炎、止痛和解热作用来进行治疗。但是西药有较大的副作用，长期服用也会对患者的胃肠功能造成影响。膝骨性关节炎在中医属“痹证”范畴，其病机以肝肾亏虚为本，感受风、寒、湿外邪，气血瘀滞为标。中医艾灸可温通经络，驱散寒邪，行气活血，消瘀散结，在治疗膝骨性关节炎方面有其独特的疗效和优势。IL-1β、COX-2、COMP在膝骨性关节炎的病理过程中均起到了重要作用。IL-1β作为一种致炎细胞因子，在炎性疼痛中主要介导炎性痛敏。COX-2在正常组织细胞内的活性极低，当受到诱导后大量产生，它通过对前列腺素（PG）合成的促进作用，介导炎症和疼痛等反应。C

OMP是软骨中非胶原蛋白的主要成分,作为一种软骨代谢标记物，软骨的损伤、修复和代谢变化均可能影响COMP的表达水平。本实验通过研究艾灸对兔膝骨性关节炎模型血清中IL-1β、COX-2、COMP表达的影响，探讨艾灸治疗膝骨性关节炎的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：健康新西兰大耳白兔22只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg,由上海中医药大学动物实验中心提供[SCXK（沪）2009-0069]，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[动物合格证号SCXK（沪）2009-0018]。

1.2 实验材料与试剂：纸管贴穴灸(泰州市灸疗研究所提供)；主要试剂：采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测IL-1β、COX-2、COMP，试剂盒（上海活乐生物科技有限公司提供），3℅戊比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司提供，批号：F20020915），庆大霉素（上海哈灵生物科技有限公司提供，批号：HL130326），95%酒精（上海哈灵生物科技有限公司提供，批号：B1227012）。

1.3 实验仪器：酶标仪：芬兰（Labsystems Mul tiskan MS），型号：352型，洗板机：芬兰（Thermo Labsystems），型号：AC8，离心机：微量高速离心机（国产），型号：TG16W，培养箱：隔水式恒温培养箱（国产），型号：GNP-9080型。

1.4 实验方法：分述如下。

1.4.1 动物造模及分组：将22只健康白兔随机分组，正常对照组6只，艾灸组和模型组均8只。其中正常对照组不做任何造模处理。艾灸组、模型组均采用Hul th骨关节炎动物模型法[1]造模。将兔用3℅戊比妥钠(30mg/ kg)静脉麻醉，仰卧固定于手术台。右膝关节局部脱毛、备皮、消毒、铺洞巾，取膝关节内侧纵切口，切断内侧副韧带，并剪断2-3mm,从髌韧带内侧切口进入关节腔，切断前交叉韧带，止血、冲洗关节腔,抽屉实验阳性后表明前交叉韧带已离断，逐层缝合。术后伤肢不予固定，置于标准动物饲养笼中自由活动及进食,手术后每只肌注庆大霉素0.5ml[2]，每日1次，连续3天。术后1周伤口愈合，驱赶兔每天活动30分钟，6周后可获得OA模型。

1.4.2 干预方法：造模成功后开始进行分组处理：艾灸组将兔置于固定器中，右侧膝关节外侧局部剪毛，将纸管贴穴灸黏贴于兔犊鼻穴，点燃施灸，燃尽后再黏再灸。施灸过程中观察兔的反应，防止其活动而艾炷脱落。每次2壮，隔日1次，每周3次，连续治疗4周。模型组将兔置于固定器中，右侧膝关节外侧局部剪毛，将纸管贴穴灸黏贴于兔犊鼻穴，不点燃，20分钟后取下。隔日1次，每周3次，连续治疗4周。正常对照组不造模，不治疗。单笼饲养，常规饮食。

1.4.3 标本采集：4周后抽取三组兔耳缘静脉血5ml，将采到的血液放在离心管里，尽量避免晃动，不要盖紧以防溶血，在室温下静置2小时，3500转离心10分钟后取血清，分装试管后置于-80℃冰箱中冷藏待测。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中IL-1β、COX-2、COMP的含量。ELISA法即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便及易于自动化操作等优点。参照ELISA试剂盒使用说明书,以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数。

1.5 统计学处理：使用SPSS 19.0统计分析软件进行统计分析，计量资料以Mean±SD表示，组间两两比较采用one-way ANOVA，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组白兔血清IL-1β、COX-2、COMP表达结果比较:与正常对照组相比，模型组和艾灸组的血清IL-1β、COX-2、COMP含量均增高（P＜0.05）；与模型组相比，艾灸组血清IL-1β、COX-2和COMP含量均降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组白兔血清IL-1β、COX-2、COMP的表达（±s）

表1 各组白兔血清IL-1β、COX-2、COMP的表达（±s）

注：与对照组比较,*P＜0.05；与模型组比较,＃P＜0.05。

组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组达英-35组SCF（ng/L）104.89±7.68 63.95±8.20★77.48±6.05 84.87±7.72▲91.45±9.92▲89.51±7.89▲例数9 9 9 9 9 9 INHB（ng/L）16.18± 6.62 29.08± 8.41★26.00±12.59 24.93± 8.22 18.27± 8.12▲28.30± 9.98

3 讨论

膝骨性关节炎是一种以关节软骨退化损伤、骨质增生为主要病变特点的退行性疾病，其病因非常复杂，可能与化学、生物、机械以及酶反应通路等因素有关。IL-1β、COX-2、COMP在其病理过程中均起到了重要作用。IL-1β大量存在于在OA软骨组织中、上层软骨细胞及基质中，可诱导基质金属蛋白酶（MMPs）合成，并激活MMPs，同时抑制基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的合成,使胶原蛋白的降解增加,通过促进软骨细胞凋亡,抑制软骨基质合成，最终导致关节软骨进行性破坏[3-4]。IL-1β通过磷酸化JNK来激活c-Jun/AP-1、降低Sox9的水平(蛋白质或mRNA)，从而抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅳ型胶原的合成，促进具有纤维母细胞特性的Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成，导致软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合成。另外，IL-1β还可促进软骨细胞分泌PGE2参与关节的炎症反应，刺激骨吸收及成骨细胞样细胞增殖,导致关节骨、软骨增生性变化。

COX-2是炎症过程中一个重要的诱导酶，在生理状态呈现低表达[5]，一旦受到细菌脂多糖(LPS)、炎症细胞因子等刺激时，会主要在软骨细胞、内皮细胞和巨噬细胞呈现高表达。COX-2促进软骨细胞将花生四烯酸转化成PGE2，软骨细胞和滑膜细胞分泌PGE2和胶原酶增加，加速软骨基质中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的分解，并抑制其合成，诱导关节软骨免疫反应增强，对膝关节软骨组织造成破坏[6]。

膝骨性关节炎可归于中医学“痹证”“骨痹”“筋痹”等范畴，本病与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关。《素问·痹论篇第四十三》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”《景岳全书》云：“盖痹者闭也，以气血为邪所闭，不得通行而病也。”强调了膝骨性关节炎发病中寒凝、血瘀、气滞的病机。灸法是以艾为主要施灸材料，点燃后在体表穴位或病变部位烧灼、温熨，借其温热、药物的刺激作用，以治疗疾病的一种方法。灸法是针灸疗法的一个重要组成部分。《灵枢·官能》明确指出“针所不为，灸之所宜”。《医学入门》说：“凡病药之不及，针之不到，必须灸之”。艾灸能温通经络、散寒逐痹，使“不通则痛”为“通则不痛”，故临床上常以艾灸来治疗膝骨性关节炎，并显现出较理想的疗效。艾灸作为中医外治法之一，具有温经通络，活血消瘀，通痹散结之功效，能有效地改变血液的高浓、高聚、高黏状态[7]。艾灸治疗膝骨关节炎的疗效已得到了大量临床研究的证实[8],本实验是对其治疗机制机理的研究。实验结果显示，与正常对照组相比，模型组和艾灸组的血清IL-1β、COX-2、COMP的含量均要增高，其差异具有统计学意义（P＜0.05），与模型组相比，艾灸组血清IL-1β、COX-2和COMP的含量均要降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明艾灸可降低血清IL-1β、COX-2和COMP含量，从而减轻炎症反应，缓解疼痛，减少关节软骨的损伤，达到一定的治疗膝骨性关节炎的效果。今后将考虑扩大样本量，进一步研究艾灸治疗膝骨性关节炎的作用机制。

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[5]罗剑刚,李慧,杨聪娴.COX-2选择性抑制剂治疗疼痛的研究进展[J].中国疼痛医学杂志,2012,18（2）：66-69.

[6]金荣忠,谈国明,胡辉东.COX-2在膝关节骨性关节炎软骨中表达及临床意义[J].生物骨科材料与临床研究,2010,7 (6)：18-20.

[7]张阳春，李秀彬.“双固一通”隔物温和灸治疗膝骨性关节炎30例临床观察[J].浙江中医杂志,2015,50(5)：382.

[8]谢洪武，陈日新，徐放明.艾灸治疗膝骨性关节炎的临床概况[J].中华中医药杂志，2012,27（9）：2374-2377.

2017-05-21