清脑止痛胶囊对利血平致偏头痛模型大鼠的影响

段浩博，包雪鹦，胡 杨，曲极冰，李 红，纪影实*

(1.吉林大学临床医学院，吉林 长春130021；2.解放军第208医院神经内科，吉林 长春130062；3.吉林大学基础医学院 药理系，吉林 长春130021)

清脑止痛胶囊对利血平致偏头痛模型大鼠的影响

段浩博1，包雪鹦2，胡 杨3，曲极冰3，李 红3，纪影实3*

(1.吉林大学临床医学院，吉林 长春130021；2.解放军第208医院神经内科，吉林 长春130062；3.吉林大学基础医学院 药理系，吉林 长春130021)

目的 研究清脑止痛胶囊(QNZTJN)对利血平致偏头痛模型大鼠血浆和中脑组织相关神经递质及炎性因子的影响。方法 90只健康雄性Wistar大鼠，随机均分为6组：空白组，模型组，阳性药正天丸组(ZTW，0.006 g/kg)，清脑止痛胶囊剂量低(QNZTJN-L，0.35 g/kg)、中(QNZTJN-M，0.7 g/kg)、高(QNZTJN-H，1.4 g/kg)组。皮下注射利血平(0.7 mg/kg)14 d建立偏头痛模型，造模第4 d开始灌胃给药11 d，观察末次给药后3 h内大鼠行为学反应；免疫组织化学法及Western blot法，检测大鼠中脑组织核因子kappa B(NF-κB)和环氧合酶2(COX-2)表达水平；酶联免疫法，检测大鼠血浆和中脑组织5-羟色胺(5-HT)、前列环素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)含量水平。结果 模型组与空白组相比，大鼠挠头次数显著增加(P<0.01)，NF-κB、COX-2在中脑组织表达显著增加(P<0.01)，5-HT在血浆和中脑组织含量显著降低(P<0.01)，PGE2、TNF-α、IL-1β在血浆和中脑组织含量显著升高(P<0.05，P<0.01)。QNZTJN-M、QNZTJN-H组和ZTW组与模型组相比，大鼠挠头次数显著减少(P<0.05，P<0.01)，NF-κB、COX-2在中脑组织表达显著降低(P<0.05，P<0.01)，5-HT在血浆和中脑组织含量显著升高(P<0.05，P<0.01)，PGE2、TNF-α、IL-1β在血浆和中脑组织含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。结论 清脑止痛胶囊可缓解利血平致大鼠偏头痛症状，其作用机制可能与调节神经源性炎症和单胺类神经递质释放有关。

清脑止痛胶囊；利血平；偏头痛；单胺类神经递质；神经源性炎症

(ChinJLabDiagn,2017,21:1415)

偏头痛具有显著的反复发作搏动性头痛特征，对声、光、头部晃动等刺激较敏感。目前仍未完全阐明其复杂的发病机制，偏头痛的药物治疗效果仍不理想[1]。研究表明，脑膜血管扩张、异常炎症反应和单胺类神经递质减少是偏头痛发病机制的重要环节，与肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子kappa B(NF-κB)、白介素1β(IL-1β)等炎症因子及5-羟色胺(5-HT)等单胺类神经递质密切相关[2-4]。川芎和天麻为清脑止痛胶囊的主要成分，已有研究表明对偏头痛有良好疗效[5]。本实验采用注射利血平复制偏头痛大鼠模型，观察清脑止痛胶囊对利血平致偏头痛大鼠血浆和中脑组织中炎症因子及单胺类神经递质的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠90只，体重190 g-210 g，吉林大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(吉)-2007-0003。

1.2 药品和试剂 清脑止痛胶囊，由吉林敖东洮南药业股份有限公司生产；正天丸，由华润三九医药股份有限公司生产；利血平注射液，由天津金耀药业有限公司生产；本实验所需的酶联免疫检测试剂盒，均购于安迪生物科技有限公司；兔抗大鼠COX-2单克隆抗体、兔抗大鼠NF-κB单克隆抗体，由艾博抗贸易有限公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 分组、造模及给药 雄性Wistar大鼠90只随机均分为6组，即空白组，模型组，ZTW组，QNZTJN-H、QNZTJN-M、QNZTJN-L组。空白组皮下注射生理盐水，其余各组注射利血平造模(0.7 mg/kg)，连续14 d，于造模第4 d开始灌胃给药，连续11 d。清脑止痛胶囊高、中、低及正天丸给药剂量分别为1.4 g/kg、0.7 g/kg、0.35 g/kg、0.006 g/kg，其余组灌胃给予适量蒸馏水。

1.3.2 行为学评分 末次给药后，观察各组大鼠在3 h内的挠头次数。

1.3.3 取材及标本处理 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后腹主动脉采血，4℃、4 000 r/min离心20 min，取上层清液检测生化指标。每组取10只剥离中脑，裂解组织匀浆，4℃、4 000 r/min离心20 min，取上层清液检测生化指标，剩余5只剥离中脑10%福尔马林固定。

1.3.4 指标检测 酶联免疫法，检测血浆与中脑5-HT、PGE2、TNF-α和IL-1β含量；免疫组化法和Western Blot法，检测大鼠中脑COX-2、NF-κB水平。实验方法按照本课题已发表文献所诉进行[6]。

2 结果

2.1 清脑止痛胶囊对偏头痛大鼠行为的影响

末次给药后3h内，与空白组相比，模型组挠头次数显著增加(P<0.01)；与模型组相比，清脑止痛胶囊组挠头次数减少，其中高剂量组与中剂量组显著减少(P<0.05，P<0.01)，具有一定的剂量依赖性，结果见图1。

1：空白组；2：模型组；3-5：清脑止痛胶囊低、中、高组；6：正天丸组**P<0.01，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较

2.2 清脑止痛胶囊对偏头痛大鼠中脑组织NF-κB表达的影响

免疫组化，与空白组相比，模型组中脑NF-κB表达呈阳性的细胞比例显著增加(P<0.01)；与模型组相比，清脑止痛胶囊中剂量、高剂量组中脑NF-κB表达呈阳性的细胞比例显著减少(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的剂量依赖性，结果见图2。WesternBlot，与空白组相比，模型组中脑NF-κB表达显著升高(P<0.01)；与模型组相比，清脑止痛胶囊中剂量、高剂量组中脑NF-κB表达显著降低(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的剂量依赖性，结果见图3。

2.3 清脑止痛胶囊对偏头痛大鼠中脑组织COX-2表达的影响

免疫组化，与空白组相比，模型组中脑COX-2表达呈阳性的细胞比例显著增加(P<0.01)；与模型组相比，清脑止痛胶囊中剂量、高剂量组中脑COX-2表达呈阳性的细胞比例显著减少(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的剂量依赖性，结果见图4。WesternBlot，与空白组相比，模型组中脑COX-2表达显著升高(P<0.01)；与模型组相比，清脑止痛胶囊中剂量、高剂量组中脑COX-2表达显著降低(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的剂量依赖性，结果见图5。

A：空白组；B：模型组；C：正天丸组；D-F：清脑止痛胶囊低、中、高组

A，B：1：空白组；2：模型组；3-5：清脑止痛胶囊高、中、低组；6：正天丸组**P<0.01，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较

2.4 清脑止痛胶囊对偏头痛大鼠血浆和中脑5-HT、PGE2、TNF-α、IL-1β含量的影响

与空白组相比，模型组血浆和中脑的5-HT含量显著降低(P<0.01)，PGE2、TNF-α、IL-1β含量显著增加(P<0.05，P<0.01)，；与模型组相比，清脑止痛胶囊高剂量、中剂量组血浆和中脑的5-HT含量显著升高(P<0.05，P<0.01)，PGE2、TNF-α、IL-1β含量显著降低(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的剂量依赖性，结果见表1。

3 讨论

偏头痛具有复杂的发病机制且临床尚无理想的治疗药物，于中医属“头痛”“头风”“偏正头痛”范畴，可从风、寒、痰、虚、火、瘀等方面入手治疗[7]。清脑止痛胶囊有效成分为天麻、川芎、蒺藜、丹参等，对偏头痛肝风夹瘀证有良好效果[8]。

A：空白组；B：模型组；C：正天丸组；D-F：清脑止痛胶囊低、中、高组

组别5⁃HT血浆(ng/L)中脑(ng/mg)PGE2血浆(ng/L)中脑(ng/g)TNF⁃α血浆(ng/L)中脑(ng/g)IL⁃1β血浆(ng/L)中脑(ng/g)空白组425．43±20．125．10±0．35181．12±10．233．67±0．2754．42±6．432．12±0．1710．37±2．03206．89±17．24模型组177．95±18．03∗∗2．85±0．30∗∗227．87±20．56∗9．43±0．85∗∗69．18±9．62∗6．37±0．58∗∗15．40±2．18∗∗405．16±32．21∗∗正天丸组281．17±10．38##4．03±0．41##192．37±16．744．78±0．32##61．73±9．442．92±0．36##12．03±1．14#266．97±15．65##QNZTJN⁃L206．82±21．36#3．12±0．51#208．43±22．177．78±0．47#68．28±6．276．08±0．40#13．65±1．28394．36±30．14QNZTJN⁃Z252．59±25．57##4．02±0．59##193．27±18．355．47±0．30##60．47±3．23#4．19±0．27##12．59±2．10#346．08±18．54#QNZTJN⁃G351．32±20．58##4．60±0．42##188．29±15．83#4．28±0．35##55．71±4．38#3．32±0．22##11．25±1．61##270．47±19．72##

*P<0.05，**P<0.01，模型组与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较

A，B：1：空白组；2：模型组；3-5：清脑止痛胶囊高、中、低组；6：正天丸组**P<0.01，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较

目前认为，偏头痛发病机制可能与三叉神经系统引起的硬脑膜无菌性炎症及中枢、外周5-HT代谢紊乱有关[1,9]。因此本实验从单胺类神经递质和神经源性炎症入手，研究偏头痛的发病机制。利血平是一种肾上腺素能阻断剂，能消耗周围交感神经的去甲肾上腺素，从而使血管扩张；同时消耗脑内的儿茶酚胺和5-HT，从而产生偏头痛样症状。因此，利血平致偏头痛大鼠模型是一种可行的模型[10]。

5-HT代谢紊乱是导致偏头痛的关键物质，在偏头痛的整个病理过程中起着重要作用[11-12]。目前许多临床治疗药物通过干预5-HT递质代谢，预防或改善偏头痛症状。本实验结果发现，清脑止痛胶囊能显著提高利血平致偏头痛大鼠中脑及血浆的5-HT含量，改善缓解偏头痛症状。

NF-κB静息状态下存在于胞浆，激活后能迅速转移到胞核，可调控免疫相关分子等多种基因的表达，从而参与许多炎症因子的调控。NF-κB在胞浆中一般为p65-p50二聚体形式，与抑制因子IκB结合呈非激活状态，一些内外刺激因素导致IκB发生磷酸化解离，NF-κB激活进入胞核，特异性调控炎症和应激相关基因，进而增强如TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-2、IL-6等的转录，最终参与炎症反应的病理生理过程。研究发现，在大鼠偏头痛模型中，NF-κB在三叉神经分布的硬脑膜及三叉神经尾核处表达显著升高，参与炎症反应，从而加剧偏头痛的症状[13]。本实验结果发现，利血平致偏头痛大鼠中脑和血浆的NF-κB表达增加，清脑止痛胶囊可降低NF-κB的表达。

COX-2被称为“炎症反应基因”，正常生理状态表达量较少，受到相关刺激后迅速合成，与炎症病理生理过程密切相关。研究表明，NF-κB能诱导COX-2的表达参与慢性疼痛过程[14]。本实验发现，利血平致偏头痛大鼠中脑和血浆中COX-2表达增加，清脑止痛胶囊可降低COX-2表达。此外，PGE2是COX-2的催化产物之一，参与炎症介导，能促进炎症相关反应。临床研究发现，偏头痛症状患者的唾液和血液中PGE2含量显著升高[15]。本实验同样发现，利血平致偏头痛大鼠中脑和血浆PGE2表达增加，清脑止痛胶囊可降低PGE2表达。

细胞因子IL-1β、TNF-α是体内重要的炎性介质，脑内由神经元和胶质细胞合成分泌，且两者均能增强机体痛觉敏感性，从而参与神经源性疼痛。研究表明，偏头痛患者脑脊液和血浆IL-1β、TNF-α水平均升高[16-18]。本实验结果表明，利血平致偏头痛大鼠中脑及血浆IL-1β、TNF-α表达增加，清脑止痛胶囊可降低IL-1β、TNF-α表达。

综上所述，本实验结果表明，清脑止痛胶囊能使利血平致偏头痛模型大鼠中脑或血浆中的单胺类神经递质5-HT等水平升高，使神经源性炎症相关炎症因子NF-κB、COX-2、PGE2、IL-1β、TNF-α等水平降低，从而对偏头痛起到预防治疗作用。

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Effects of QNZTJN on migraine rats induced by reserpine

DUANHao-bo,BAOXue-ying,HUYang,etal.

(CollegeofClinicalMedicine,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To detection the effects of QNZTJN on migraine rat model induced by reserpine.Methods Totally 90 Wistar rats (males) were randomly divided into normal group，model group，ZTW positive group (0.006 g/kg)，QNZTJN high dose group (1.4 g/kg)，QNZTJN medium dose group (0.75 g/kg)，QNZTJN low dose group (0.35 g/kg).The migraine model rats were induced by subcutaneous injection 0.7mg/kg reserpine to observe the forelimb scratching frequency and the effects of different concentrations of QNZTJN on the level of NF-κB，COX-2，5-HT，PGE2，TNF-α and IL-1β in the midbrain tissue and plasma.Results Compared with the normal group，the forelimb scratching frequency were increased significantly in model group (P<0.01).The contents of COX-2 and NF-κB in midbrain tissue were increased significantly (P<0.01).The contents of PGE2，TNF-α and IL-1β were increased，on the contrary the contents of 5-HT was decreased in both midbrain tissue and plasma (P<0.05，P<0.01).Compared with model group，QNZTJN medium and high dose significantly decreased the forelimb scratching frequency of rats (P<0.05，P<0.01).The contents of COX-2 and NF-κB in midbrain tissue were decreased significantly (P<0.05，P<0.01).The contents of PGE2，TNF-α and IL-1β were decreased，while the contents of 5-HT was increased in both midbrain tissue and plasma (P<0.05，P<0.01).Conclusion The QNZTJN can relieve migraine attacks induced by reserpine，which may be related to regulating the release of monoamine neurotransmitters and neurogenic inflammation.

QNZTJN; reserpine; migraine; monoamine neurotransmitters; neurogenic inflammation

吉林省科技厅项目基金支持(20140310001YY)

1007-4287(2017)08-1415-05

R742

A

段浩博(1995-)，男，在读医学本科生，主要从事中枢神经系统药理学研究。

2016-04-10)

*通讯作者