HPLC-MS/MS与ICP-MS分别测定血液中14种全氟化合物及常见金属元素

张睿佳,周枝凤,李敏杰,李子焕,曾利兰,马安德*

(1.南方医科大学 公共卫生学院 卫生检验检疫学系，广东 广州 510515；2.华银检测中心，广东 广州 510515)

HPLC-MS/MS与ICP-MS分别测定血液中14种全氟化合物及常见金属元素

张睿佳1,周枝凤1,李敏杰1,李子焕1,曾利兰2,马安德1*

(1.南方医科大学 公共卫生学院 卫生检验检疫学系，广东 广州 510515；2.华银检测中心，广东 广州 510515)

为了解广东儿童血液中全氟化合物(PFCs) 和常见金属元素的含量水平，为儿童健康评估提供数据，该文采用蛋白沉淀法提取样品，高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测样品中14种PFCs。同时，以石墨全自动消解仪消解血液样品，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS) 检测血液中钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、锌(Zn)、铜(Cu) 和锰(Mn) 元素。结果显示，儿童血液中14种PFCs被普遍检出，其中全氟辛基磺酸(PFOS) 和全氟辛基羧酸(PFOA) 的检出率及浓度最高，但在一些个体中发现较高浓度的其它碳链PFCs。PFCs浓度有随着年龄增长而下降的趋势，但除了全氟丁基磺酸外，无性别差异。另一方面，儿童血液中检出的Ca、Mg、Fe、Zn、Cu和Mn含量在正常范围内，未发现有性别差异。研究显示PFCs普遍存在儿童血液中，儿童PFCs暴露水平的研究应引起重视。在今后的监测中，不仅要关注PFOS和PFOA，也要关注其它碳链PFCs。

全氟化合物；金属元素；HPLC-MS/MS；ICP-MS

全氟化合物(Perfluorinated compounds,PFCs) 是一类碳原子上的氢原子均被氟原子取代的人造有机化合物。PFCs因拥有极高的表面活性和独特的疏水疏油特性，被广泛应用于商业和工业产品中，如疏水表面活性剂、阻燃剂、光致抗蚀剂、疏油抗污剂、涂料添加剂等。PFCs具有极强的热、化学和生物稳定性，能持久地存在于自然环境中[1]。2009年5月，在瑞士日内瓦召开的第四届斯德哥尔摩公约缔约国大会上，全氟辛基磺酸及其盐类(PFOS)被作为一类重要的新型持久性有机污染物，列入公约附件B中加以限制[2]。PFCs的环境污染问题已十分严重，几乎所有的环境介质和生物体中均发现了PFCs，无论是在地表水、地下水、自来水、土壤、沉积物和污水污泥，还是各种生物体的组织和血液中，甚至在人迹罕至的北极地区，也发现了PFCs的踪迹[3]。

动物实验和人群流行病学研究表明：PFCs具有肝脏毒性、神经毒性、发育与生殖毒性、内分泌干扰和致癌作用等多种毒性，被认为是一类具有全身多脏器毒性的环境污染物[4]。PFCs对人体健康具有较大危害，尤其是影响儿童健康[5-6]。儿童处于生长发育的敏感阶段，多种器官易受到环境有害物损害。因此，十分有必要关注儿童PFCs的暴露水平。 此外，长期的研究已经证实钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、锌(Zn)、铜(Cu) 和锰(Mn) 等常见金属元素与人体健康息息相关[7]。PFCs的暴露会对人体健康造成危害，常见金属元素的过量或者缺乏也会对人体健康造成影响，同时分析两者在血液中的含量情况，有助于进一步的健康监测，为预防策略提供依据。

从2001年至2006年，中国的全氟辛基磺酸(PFOS)生产量从不足50吨/年增长到250吨/年，截至2011年PFOS的生产量累积达到1 800吨[8]。在中国，大部分PFCs的制造厂商位于东部和南部，尤其是沿海地区，如浙江省、福建省和广东省等[9]。 广东省是中国人口最多和最发达的省份之一[10]，学者对PFCs的研究主要集中在水体、大气和土壤等环境介质方面，有关人群暴露水平的研究缺乏，特别在儿童方面。本研究旨在了解广东儿童血液中PFCs和常见金属元素的含量水平，为儿童健康评估提供数据支持。

1 实验部分

1.1 实验对象

2015年10月至2015年12月收集广东省珠三角地区336份0～7岁儿童血样。

1.2 仪器与试剂

SHIMADZU LC-20A DXR液相色谱输入泵、SHIMADZU LC-20AX进样器、SHIMADZU CTO-20A 柱温箱(日本岛津公司)；API4000-Qtrap Mass Spectrometer System 三重四极杆质谱仪(美国应用生物系统公司)。Vortex-5 涡旋混合器(江苏海门其林贝尔)，CT15RT 高速冷冻离心机(上海天美公司)，KQ-500DB 超声仪(江苏昆山超声公司)，电感耦合等离子体质谱仪(美国热电-赛默飞公司)，Milli-Q Elixt超纯水系统(美国密理博公司)。

全氟丁酸(PFBA，98%)、全氟戊酸(PFPeA，98%)、全氟己酸(PFHxA，98%)、全氟庚酸(PFHpA，98%)、全氟癸酸(PFDA，97%)、全氟十一酸(PFUnDA，95%) 和全氟丁基磺酸(PFBS，98%) 购自德国CNW公司。全氟壬酸(PFNA，97%)、全氟十二酸(PFDoDA，96%) 和全氟十四酸(PFTeDA，96%) 购自英国Alfa公司。全氟十三酸(PFTrDA，96%)和全氟己基磺酸(PFHxS，98%) 购自美国Sigma-Aldrich公司。全氟辛酸(PFOA，95.5%) 和PFOS(98%)购自Dr.Ehrenstorfer公司。内标物质13C4-全氟辛酸(MPFOA) 和13C4-全氟辛基磺酸(MFPOS)，购自加拿大Wellington实验室。色谱纯的甲醇和乙腈购自德国Merck公司。Ca、Mg、Fe、Zn、Cu 和Mn标准溶液购自美国NSI Solution公司。浓硝酸购自广州化学试剂厂。

1.3 HPLC-MS/MS条件

负离子模式下多反应监测(MRM)，离子源参数：GAS1为50 psi、GAS2为60 psi、CUR为30 psi、离子源温度650 ℃，两对离子对进行监测。分析色谱柱： Accucore C18(2.6 μm,100 mm×4.6 mm,美国热电公司)，捕集色谱柱：Hypersil GOLD C18(5 μm,50 mm×4.6 mm,美国热电公司)。柱温为40 ℃，流速0.8 mL/min，进样量5 μL。流动相为甲醇(A)-5 mmol/L醋酸铵(B)溶液，整个梯度洗脱时间为10 min。梯度洗脱程序：0～1.5 min，70%B，1.5～2.5 min，70%～30%B，2.5～4.5 min，30%～10%B，4.5～6.5 min，10%B，0.5 min后升至70%B直到10 min。

1.4 ICP-MS条件

仪器在使用前至少预热稳定0.5 h，使用质谱调谐液在STD模式下对仪器的灵敏度、氧化物和双电荷等进行调谐至达到检测要求。冷却气流速为13.84 L/min，辅助气流速为0.795 L/min，载气流速为0.93 L/min，RF功率为1 548.6 W，采样深度为5 mm，重复次数为3次，停留时间为0.05 s。

1.5 样品的处理方法

血浆样品前处理方法参考Lien等[11]报道的方法。移取0.2 mL血浆于EP管中，随后依次加入0.04 mL 100 ng/mL内标溶液，0.05 mL甲醇-水(体积比1∶1) 和0.4 mL乙腈。涡旋1 min后，于13 000 r/min离心10 min，移取0.55 mL上清液于进样小瓶中，进行HPLC-MS/MS分析。

移取0.5 mL 全血于消解罐内，加入6 mL 65%硝酸，加热100 ℃，消解4 h，消解完全冷却后，超纯水定容至25 mL，进行ICP-MS分析[12]。

1.6 统计分析

2 结果与讨论

2.1 HPLC-MS/MS条件优化

选择甲醇作为流动相时大多数PFCs能获得更好的灵敏度、峰形和分辨率[1]。为了获得最佳的分离条件，本研究考察了流动相中缓冲盐的种类(甲酸和乙酸铵)及浓度(2、5、10、15 mmol/L) 的影响。结果表明，当以甲酸为流动相的缓冲盐时，得到的PFCs峰宽大、峰形差、信号低。流动相中乙酸铵浓度为2 mmol/L时，PFCs尤其是PFPeA的响应信号低。当乙酸铵浓度>10 mmol/L时，大多数PFCs的响应信号受到抑制并且PFBA峰拖尾。相比之下，流动相中乙酸铵为5 mmol/L时，各PFCs的峰形良好，响应高，因此选择5 mmol/L乙酸铵为缓冲盐，优化得到最佳的梯度洗脱程序如“1.3”所述。Zabaleta等[14]在流动相中加入离子对试剂1-甲基吡啶，以改善响应信号和峰形。本研究无需在流动相中添加离子对试剂，即能获得尖锐和对称的峰。图 1为加标样品的典型TIC色谱图。

在负离子模式下，PFCs具有较高的灵敏度，故监测模式选择负离子模式。为了获得较高响应信号，用200 ng/mL的PFCs标准溶液优化离子源参数(电压、温度和辅助气流等) 和质谱条件(去簇电压和碰撞能等)。每个PFCs有2对离子对，选取响应高的1对离子对作为定量离子对，另1对作为定性离子对(除了PFBA和PFPeA)。具体的优化参数见表1。

2.2 质量控制与保证

为控制操作过程中的污染，每隔20个血浆样品，做1个操作空白样(纯水)。实验所用的器材和试剂，均经过LC-MS/MS检测，无PFCs检出。为了保证分析数据的可靠性，每20个血浆样品随行1个质控样品。14种PFCs的方法检出限和定量下限分别为0.03～0.15 ng/mL和0.1～0.5 ng/mL。将低、中和高3个水平的标准溶液(2、10、40 ng/mL) 加入初生小牛血清中，连续3 d每个浓度点重复测定3次，获得14种PFCs的相对回收率为 92.2%～113.6%；基质效应值为100%时，表示无基质干扰，本文获得14种PFCs的基质效应范围为83.8%～106.1%；批间和批内准确度范围为80.1%～112.3%；批间和批内相对标准偏差<13%。

表1 全氟化合物的液相色谱和质谱参数

*quantification transition

2.3 血液中PFCs的测定

在儿童血浆中14种PFCs均能被检出，PFOS和PFOA的检出率接近100%，其余12种PFCs的检出率<70%。因PFBA和PFTeDA的检出率<10%，这两种物质不再进行下一步统计比较。儿童血浆中PFOS的平均和中位浓度最高，分别为49.2、22.7 ng/mL；其次是PFOA，平均值为4.0 ng/mL，中位值为2.6 ng/mL；其余12种PFCs的平均值和中位值均小于1 ng/mL(图2)。 本文所测儿童血液中PFOS和PFOA浓度高于南昌市和原阳县儿童血液浓度[15-16]，这可能与人口数量和工业化程度有关。南昌市常住人口约400万，而珠三角地区常住人口达到5 874.27万[16]。河南省是农业大省，工业化程度比珠三角地区低，并且原阳县是河南省的贫困县[15]。儿童血浆中PFOS和PFOA仍是2种最主要的PFCs，这与之前的研究结果一致[15,17]。 但本文短链PFCs(碳链<6，即PFBA、PFPeA和PFHxA) 的检出率和浓度高于文献报道[18-19]。据报道，近几年主要的氟化合物制造商改用短链PFCs来取代PFOS和PFOA[20]，这能部分解释某些个体中出现较高浓度的其它碳链PFCs的原因。

儿童血浆中PFCs浓度随着年龄的增长而下降，除了PFPeA 和 PFHpA，表明儿童在胎儿期或者婴儿期有高水平的PFCs暴露，这可能与PFCs通过胎盘和母乳进入婴儿体内有关[21- 22]。 男童血浆中14种PFCs浓度的高低顺序依次为：PFOS>PFOA>PFHxS>PFNA>PFDA>PFUnDA>PFPeA>PFHxA>PFHpA>PFDoDA≈PFTrDA≈PFBS≈PFBA≈PFTeDA，在女童血浆中也发现相似的浓度次序。经Mann-Whitney U检验分析后，只发现男童血浆中PFBS浓度高于女童(p<0.01)。男童血浆中PFBS的浓度很低(<0.1 ng/mL)，因而，本文中不同性别儿童血浆中PFBS的差异，可能是由抽样误差引起。儿童血浆中PFCs浓度彼此间的相关系数范围为-0.267～0.472(p<0.05)，PFHpA、PFOA、PFNA和PFDA相互间的相关系数较强，表明这几种PFCs的暴露来源相似。在来自中国12个城市的人群和深圳人群的研究中，亦发现PFHpA、PFOA、PFNA和PFDA相互间有强相关性[23- 24]。

2.4 血液中金属元素的测定

儿童血液中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu和Mn的平均值分别为76.47、36.67、412.71、4.54、1.06、17.31 mg/L，中位值分别为76.37、36.43、416.25、4.54、1.03、16.7 mg/L。个体血液中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu和Mn的含量在正常范围内。男童血液中Ca、Mg和Cu的浓度高于女童，反之另外3种金属元素在女童血液中较高，但经t检验后，均未发现有统计学差异。

3 结 论

PFCs普遍存在儿童血液中。虽然PFOS和PFOA的含量最高，但在一些个体中能检出较高浓度的其它碳链PFCs。在今后的监测中，不仅要关注PFOS和PFOA，还要关注其它碳链PFCs。PFCs浓度有随着年龄增长而下降的趋势，关注儿童早期PFCs的高暴露，减少儿童早期暴露，有利于避免PFCs对儿童造成的健康危害。儿童血液中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu和Mn的含量在正常水平内，并且没有性别差异。这在一定程度上体现国内宣传教育常见金属元素对人体重要性的工作成效，家长对于儿童补充常见金属元素的意识提高。

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Analysis of 14 Perfluorinated Compounds and Common Metal Elementsin Blood by HPLC-MS/MS and ICP-MS

ZHANG Rui-jia1,ZHOU Zhi-feng1,LI Min-jie1,LI Zi-huan1,ZENG Li-lan2,MA An-de1*

(1.Hygiene Detection Center,School of Public Health,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2.Huayin Testing Center,Guangzhou 510515,China)

The aim of this paper was to understand the concentrations of perfluorinated compounds(PFCs) and common metal elements in children’s blood and provide data for the assessment of children’s health.The samples were extracted by protein precipitation,and then detected by high liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Meanwhile,the samples were digested with graphite automatic instrument,and then calcium(Ca),magnesium(Mg),iron(Fe),zinc(Zn),copper(Cu) and manganese(Mn) in samples were determined by inductively coupled plasma-mass spectrometry(ICP-MS).The PFCs in children’s blood were widely detected.The frequencies and concentrations of perfluorooctane sulfonate(PFOS) and perfluorooctanoic acid(PFOA) were the highest,whereas some other PFCs with higher concentrations were found in some blood samples.A negative correlation was found between the concentrations of PFCs and the children’s age.There was no gender difference in the concentrations of PFCs except perfluorobutane sulfonate.The concentrations of Ca,Mg,Fe,Zn,Cu and Mn were in normal range.The PFCs in children’s blood were widely determined.Concerns regarding children exposure to PFCs are needed.Focus should be paid not only on PFOS and PFOA,but also on other PFCs in the future monitoring.

perfluorinated compounds；metal elements；HPLC-MS/MS；ICP-MS

2017-05-05；

2017-05-15

国家自然科学基金(21607070)；国家科技重大专项(2012ZX09103101-053)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.005

O657.7；O657.63

A

1004-4957(2017)08-0975-05

*通讯作者：马安德，博士，教授，研究方向：环境污染和毒药物研究，Tel：020-61648462,E-mail:mandmy@smu.edu.cn