超声量化指标评价白藜芦醇对大鼠肝纤维化的影响

桑 亮，王学梅，许东阳，商功群，袁胜美，屠树星

（中国医科大学附属第一医院超声科，辽宁 沈阳 110001）

◁腹部影像学▷

超声量化指标评价白藜芦醇对大鼠肝纤维化的影响

桑 亮，王学梅，许东阳，商功群，袁胜美，屠树星

（中国医科大学附属第一医院超声科，辽宁 沈阳 110001）

目的：通过超声量化指标观察白藜芦醇（Resveratrol，RES）对CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型的影响。方法：20只健康雄性SD大鼠随机分为4组：对照组、RES组、模型组、RES干预组。造模8周后超声检测门静脉近段与远段内径、血流速度及肝组织杨氏模量，大鼠肝组织HE染色，光镜下判定肝纤维化程度。结果：①RES干预后大鼠症状较轻，体质量有所增加，肝纤维化病理得到改善。②大鼠门静脉近段与远段内径在模型组与RES干预组较对照组与RES组均增宽（P＜0.05）；门静脉血流速度在模型组与RES干预组较对照组与RES组均增加，但在各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；肝组织杨氏模量在模型组与RES干预组较对照组与RES组均升高（P＜0.05）。RES干预后门静脉内径及杨氏模量改变幅度有所减低。各指标在对照组与RES组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论：①RES可以有效改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化病理改变。②门静脉内径与杨氏模量可以有效评价RES对CCl4诱导大鼠肝纤维化的影响。

肝硬化；大鼠；超声检查

肝纤维化是指各种致病因素引起肝脏损害和炎症，在修复过程中导致肝脏细胞外基质异常增多和过度沉积的病理过程[1]。目前，肝纤维化的随访与药物疗效评价主要依靠影像学检查及血清学指标，超声因其具有无创、经济、可重复性强等优势，往往成为临床诊治的首选检查手段，但是二维超声对肝实质回声的判定存在主观性，难以进行定量分析[2－3]。白藜芦醇（Resveratrol，RES）具有显著抗炎、抗氧化作用，有效保护肝脏不受损害[4]。本研究通过CCl4复制肝纤维化模型，并以病理做为金标准，通过超声量化指标评价RES对大鼠肝纤维化的影响，为临床上肝纤维化的随访、药物疗效及预后观察提供更为充分的理论基础和实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD 大鼠，雄性，健康，清洁级，体质量（200±20） g，购于辽宁长生生物技术有限公司。所有实验大鼠均分笼饲养，普通饲料喂养，自由进水。房间温度保持在20℃～25℃，湿度在45%～60%。

1.2 方法

1.2.1 制备动物模型

健康成年SPF级SD雄性大鼠20只，体质量（200±20）g，适应性饲养 1 周，随机分为 4 组，A 组：对照组，B 组：RES组，C 组：模型组，D 组：RES干预组。用橄榄油将CCl4配成40%的溶液进行造模。A组：大鼠灌胃与RES等体积羧甲基纤维素钠（Sodium carboxymethyl cellulose，CMC），1 次/d，30min 后腹腔注射与CCl4等体积的橄榄油，2次/周，连续8周。B组：大鼠灌胃RES溶液（提前用CMC溶解），20mg/kg，1次/d，30min后腹腔注射与 CCl4等体积的橄榄油，2次/周，连续8周。C组：大鼠灌胃与RES等体积 CMC，1次/天，30 min后腹腔注射 40%的CCl4溶液（用橄榄油配制），2mL/kg，2 次/周，连续 8周。D 组：大鼠灌胃 RES 溶液，20mg/kg，1 次/d，30min后腹腔注射 40%的 CCl4溶液，2mL/kg，2 次/周，连续8周。

1.2.2 大鼠肝脏超声检查

检查前准备：大鼠称重并记录，用10%的水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于平板上，电动剃发刀去除腹部体毛。

超声仪器：应用法国声科Supersonic彩色超声诊断仪，配有实时剪切波弹性成像（Shear wave elastrography，SWE）功能，选用线阵探头，探头频率4～15MHz。

超声检测：①门静脉内径，二维条件下清晰显示门静脉主干，冻结图像，测量距门静脉入肝处约0.5～0.75 cm、1.5～2.0 cm 处门静脉内径，分别标记为门静脉近段内径（Proximal diameter of portal vein，PDPV）与门静脉远段内径（Distal diameter of portal vein，DDPV），各测量 3 次，取平均值（图 1a，1b）。 ②门静脉血流速度 （Blood flow velocity of portal vein，VPV），二维条件下清晰显示门静脉主干，开启CDFI模式，血流信号显示稳定后打开PW模式，频谱稳定状态下冻结图像，测量VPV，连续测量3次，取平均值（图2）。③实时剪切波弹性成像（SWE）技术检测肝组织杨氏模量，二维条件下清晰显示肝脏右叶或左叶，开启SWE模式，图像稳定后冻结图像，选取ROI测量弹性值，以kPa为单位。图像以ROI填充均匀一致的蓝色时为准。启动仪器提供的QBOX功能定量测量成像区域内的肝脏杨氏模量值，设定Q－BOX区域直径为3mm，测量3次并记录杨氏模量平均值（图3）。

1.2.3 病理学检查

大鼠用生理盐水进行心脏灌流，待灌流液清澈后切除肝脾组织称重，取一小部分肝组织立刻以10%的甲醛固定48 h以上，石蜡包埋，间距4μm连续切片，HE染色。由病理科专业医生对肝纤维化程度进行分析、判定。肝纤维化病理诊断参照《病毒性肝炎防治方案》[5]中的病理诊断标准，根据汇管区及周围纤维化情况及小叶结构，将纤维化程度从无到重分为S0～S4共5期。

1.3 统计学分析

图1 门静脉内径测量。图1a为门静脉近段内径，距门静脉入肝处约0.5～0.75 cm；图1b为门静脉远段内径，距门静脉入肝处约1.5～2.0 cm。 图2 门静脉血流速度测量。血流信号显示稳定后打开PW模式，频谱稳定状态下冻结图像进行测量。 图3 SWE采集成功超声图像。采集区域取样框内颜色均匀一致且定量测量区域Q－BOX内颜色完全充满。Figure 1. Measurement of portal vein diameter.Figure 1a:PDPV,about 0.5～0.75 cm from the position of portal vein entering liver;Figure 1b:DDPV,about 1.5～2.0 cm from the position of portal vein entering liver. Figure 2. VPV measurement:opening PW mode after steady flow signals,freezing image with steady－state spectrum. Figure 3. Ultrasound image of SWE acquisition:color of sampling frame in collection area is uniform and the quantitative measurement region of Q－BOX is completely filled with color.

2 结果

2.1 一般情况与病理改变

2.1.1 一般情况

大鼠死亡4只，其中模型组死亡2只，RES干预组死亡1只，RES组麻醉过程中死亡1只，对照组大鼠全部存活。对照组及RES组大鼠饮食、精神、活动正常，体质量增长较快；模型组大鼠摄食、活动减少，精神萎靡，毛发发黄脱落，体质量增长缓慢，后期出现下降；RES干预组症状与模型组相比，症状较轻，体质量增长有所增加。大鼠体质量变化曲线见图4（末次体质量因空腹24 h，未计入）。

图4 不同组间大鼠体质量变化曲线：对照组及RES组体质量增长较快；模型组体质量增长缓慢，后期出现下降；RES干预组与模型组相比体质量增长有所增加。Figure 4.The changes of body weight among different groups.Body weight increased observably in control group and RES group,model group with slow weight growth but RES intervention could increase body weight.

2.1.2 病理改变

肝组织HE染色显示对照组及RES组肝小叶结构正常，肝细胞无变性、坏死；模型组大鼠肝组织小叶内、小叶间有炎性细胞浸润；汇管区因纤维组织增生伴有纤维间隔，肝小叶结构不清楚，假小叶形成。RES干预组肝纤维化有不同程度的改善，结缔组织增生减少，炎性浸润程度减轻（图5a～5d）。

2.2 超声检查结果

2.2.1 门静脉内径

大鼠PDPV与DDPV在模型组与RES干预组较对照组与 RES 组增宽（P＜0.05），RES 干预组相对模型组增宽幅度有所减低，两者在对照组与RES组间比较差异没有统计学意义（P＞0.05），门静脉近段内径在模型组与RES干预组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），而门静脉远段内径在模型组与 RES干预组间比较差异没有统计学意义（P＞0.05）（表 1，图 6）。

2.2.2 VPV

大鼠VPV在模型组与RES干预组较对照组与RES组均加快，RES干预组相对模型组加快幅度有所减低，但是在各组间比较差异均没有统计学意义（P＞0.05）（表 1，图 6）。

2.2.3 SWE 杨氏模量

大鼠SWE杨氏模量在模型组与RES干预组较对照组与 RES 组均升高（P＜0.05），RES 干预组相对模型组升高幅度有所减低。在模型组与RES干预组间以及对照组与RES组间比较差异均没有统计学意义（P＞0.05）（表 1，图 6）。不同组间 SWE 杨氏模量图像采集测量见图7a～7d。

图5 不同组间病理改变。图5a，5b：对照组及RES组大鼠肝组织无变性、坏死。图5c：模型组大鼠肝组织出现炎性细胞浸润；汇管区及中央静脉周围纤维组织增生，出现纤维间隔，假小叶形成。图5d：RES干预组大鼠肝纤维化出现不同程度的改善。大鼠肝组织HE染色。Figure 5. The histology changes of liver samples.Figure 5a,5b:Control group and RES group without degeneration and necrosis in liver tissue.Figure 5c:Rat liver tissue in model group showing inflammatory cell infiltration,hyperplasia of fibrous tissue around the portal area and central vein,fiber spacing and pseudolobule.Figure 5d:RES intervention group:varying degrees improvement of hepatic fibrosis.Liver tissues were stained with HE.

Table 1.Ultrasound comparison among different groups

3 讨论

肝纤维化是一种正常微循环、血管解剖学和肝脏结构被损坏，并有纤维化再生、纤维结节改变的肝病，肝硬化是肝脏纤维化的最后阶段。肝组织活检对肝纤维化判定最为可靠，目前仍是确诊肝纤维化的最主要依据。本研究病理结果表明，模型组大鼠肝组织可见肝细胞坏死，间质纤维组织增生，形成假小叶；RES干预组肝细胞坏死减轻，虽然大鼠肝组织也显示胶原纤维不同程度增生，但主要分布于肝脏间质内，无明显假小叶形成。本研究验证了RES有较好的抗肝纤维化的作用，其机理可能与保护肝细胞、减轻组织炎症、抑制胶原纤维增生有关，我们会在下一步的分子生物学研究中进行探讨。

图 6 不同组间超声结果比较，a：与对照组比较，P＜0.05；b：与 RES 组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.05。 PDPV 与 DDPV 在模型组与RES干预组较对照组与RES组均增宽，VPV在模型组与RES干预组较对照组与RES组均加快，杨氏模量在模型组与RES干预组较对照组与RES组均升高。RES干预组相对模型组变化幅度有所减低。Figure 6. Comparison of ultrasonic results among different groups.a:P＜0.05,vs control group;b:P＜0.05,vs RES group;c:P＜0.05,vs model group.Compared with the control group and RES group,PDPV and DDPV were widened,VPV and the Young’s modulus were increased in the model group and RES intervention group.The change of RES intervention group was lower than that of model group.

图7 不同组间SWE杨氏模量采集测量。图7a：对照组；图7b：RES组；图7c：模型组；图7d：RES干预组。Figure 7.SWE image acquisition and measurement among different groups.Figure 7a:Control group;Figure 7b:RES group;Figure 7c:Model group;Figure 7d:RES intervention group.

既往研究表明，肝活检会对受检者产生创伤或潜在风险，严重危及生命，较难作为随访和疗效观察的检查方法[6－7]，因此本实验通过经典CCl4药物损伤构建大鼠肝纤维化模型，并以病理做为金标准，探讨超声量化指标评价RES对大鼠肝纤维化病理改变的影响。

肝脏发生纤维化改变时肝组织纤维间隔收缩，肝内胆管周围纤维组织及胆汁不同程度的淤积加重肝小叶周围的机械压力，使门静脉的阻力增加，内径增宽。其次随着肝纤维化的加重，纤维组织过度增生伴有间隔形成，导致侧支循环建立，高压的肝动脉血流入低压的门静脉内使门静脉压力增高，导致内径增宽。温小凤等[8]、陈永鹏等[9]的研究发现随着肝纤维化程度的加重，慢性肝炎患者门静脉主干直径逐渐扩张。我们预实验研究发现，门静脉随着肝纤维化加重，PDPV与DDPV扩张程度存在差异，故本研究将门静脉分成近段与远段分别进行分析。随着肝纤维化的加重，PDPV与DDPV均有增宽的趋势，大鼠PDPV与DDPV在模型组与RES干预组较对照组与 RES 组均增宽（P＜0.05），可以起到很好的临床提示作用，而RES干预组相对模型组增宽幅度有所减低，证明了RES对肝纤维化起到了预防保护作用。PDPV在模型组与RES干预组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），而 DDPV 在模型组与 RES 干预组间比较差异没有统计学意义（P＞0.05），虽然我们观察到发生肝纤维化时，PDPV扩张不如DDPV明显，但是从统计学意义上来讲，其在疗效观察时或许更有意义。

随着影像学技术的飞速发展，超声弹性成像已成为一项无创性提供组织弹性这一基本力学属性的全新技术。而在超声弹性成像基础上发展起来的SWE技术[10]是一种全新、无创、快速、简单、客观的定量检测肝纤维化的方法。SWE技术通过检测组织内剪切波的速度获得杨氏模量这一代表组织硬度的参数[11]，反映组织硬度。杨氏模量值越大，组织越硬[12]。本研究结果显示大鼠SWE杨氏模量在模型组与RES 干预组较对照组均升高（P＜0.05），并且肝脏杨氏模量值随肝纤维化程度的加重有增高的趋势，与文献[13－14]报道的结果一致，说明SWE测得的肝弹性模量值能够反映肝组织硬度的变化，在评价肝纤维化的药物疗效中具有重要价值。

肝组织损伤和修复理论上会导致肝脏微循环动力学变化[15]。既往应用Doppler超声判定肝纤维化或肝硬化的结果存在不一致性[2，16]。Hirata等[17]的研究结果表明随着肝纤维化加重门静脉阻力提升，流速会不同程度下降，但Bernatik等[18]通过研究不同程度肝病患者发现Doppler超声不能很好的提示严重性。本研究结果表明大鼠VPV在模型组与RES干预组较对照组均加快，RES干预组相对模型组加快的幅度有所减低，但是在各组间比较差异均没有统计学意义（P＞0.05）。很难作为评价肝纤维化药物疗效及预后的有效手段。Doppler超声对于判定肝纤维化存在较大差异，可能是因为取样角度的不同，加之不同作者之间对于采样位置的选择也难以保证完全一致所致。

本研究无论从病理还是从超声量化指标都证明了RES对肝纤维化具有预防保护作用，超声检测门静脉内径与SWE杨氏模量可以有效评价RES对肝纤维化的影响，可以作为进一步评价肝纤维化药物疗效与预后的参考指标。本研究的局限性：样本量少，易存在个体差异，可能导致组间差异存在统计学误差；研究选取的动物模型，与人的肝纤维化病理改变存在差异，今后应扩大样本量，并进行超声量化指标临床试验的探讨。

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Evaluation of the effect of resveratrol on liver fibrosis in rat by ultrasound quantitative index

SANG Liang,WANG Xue-mei,XU Dong-yang,SHANG Gong-qun,YUAN Sheng-mei,TU Shu-xing
(Department of Ultrasound,the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

Objective:To investigate the effection of resveratrol(RES)on the CCl4－induced liver fibrosis in rat model by ultrasound quantitative index.Methods:Twenty male Sprague－Dawley rats were random ly divided into four groups:control group,RES group,model group,and RES intervention group.The proximal and distal diameter,blood flow velocity of portal vein and liver tissue Young’s modulus were detected by ultrasonography.The degree of hepatic fibrosis was determined under light microscope after HE stained.Results:①After RES intervention,the symptoms of rats were mild with the weight increase,and the liver fibrosis was improved.②In model and RES intervention group,the portal vein proximal and distal diameter,Young’s modulus of liver tissue were increased compared with control and RES group(P＜0.05);The portal vein blood flow velocity was increased,but the differences among the groups were not statistically significant(P＞0.05).The changes of the portal vein diameter and Young’s modulus were decreased after RES intervention.There were no significant differences between the control and RES group(P＞0.05).Conclusion:①RES can effectively improve the pathological changes of CCl4－induced liver fibrosis.②Portal vein diameter and Young’smodulus can effectively evaluate the effect of RES on CCl4－induced liver fibrosis in rat.

Liver cirrhosis;Rats;Ultrasonography

R657.31；R445.1

A

1008－1062（2017）04－0255－05

2016－09－20；

2016－10－10

桑亮（1983－），男，山东寿光人，主治医师。 E－mail：13889167622＠163.com

王学梅，中国医科大学附属第一医院超声科，110001。 E－mail：wxmlmt＠163.com