持续性和波动性高糖培养对人视网膜色素上皮细胞炎性因子表达的影响

李立琴 张云良，* 郭淑芹 王 翯 靳丽丽 董跃华 辛欢欢 刘莉芳

持续性和波动性高糖培养对人视网膜色素上皮细胞炎性因子表达的影响

李立琴1张云良1，*郭淑芹1王 翯1靳丽丽2董跃华1辛欢欢1刘莉芳1

目的：观察波动性和持续性高糖对人视网膜色素上皮细胞(HRPE)炎性因子表达的影响。方法：取常规培养对数期HRPE(2×105/ml)接种于24孔板，无血清DMEM培养至细胞同步于G0/G1期，加入条件培养液继续培养，并据此分组：(1)低浓度葡萄糖(5.5mmol/L)培养对照组(N组)；(2)不同渗透压对照培养组(P组)，包括25mmol/L渗透压对照组 (P1组，即用 5.5mmol/L葡萄糖 和 19.5mmol/L甘露醇培养)和33mmol/L渗透压对照组(P2组，即用5.5mmol/L葡萄糖 和27.5mmol/L甘露醇培养)；(3)持续性高浓度葡萄糖培养组(H组)，包括25mmol/L持续高糖培养(H1组)和33mmol/L持续高糖培养(H2组)。(4)波动性高浓度葡萄糖培养(F组)，包括25/5.5mmol/L葡萄糖交替培养(F1组，即高糖3h，低糖2h，轮替交换，日间交换3次，25mmol/L葡萄糖过夜)和33/5.5mmol/L葡萄糖交替培养(F2组，即高糖3h，低糖2h，轮替交换，日间交换3次，33mmol/L葡萄糖过夜)。各组均培养72h，并于培养24h、48h、72h检测分析HRPE培养上清液中细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量变化。结果：组内比较，同组HRPE条件培养24h、48h、72h，其上清液ICAM-1、TNF-α表达量差异无统计学意义(均P>0.05)。组间比较，P组ICAM-1和TNF-α水平与N组无明显差异(P>0.05)，H组和F组均高于N组(P<0.01)，F组较H组升高更显著(P<0.01)，P1和P2、H1和H2、F1和F2各两亚组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：波动性高浓度葡萄糖刺激对HRPE的炎性损伤较持续性高糖更为明显，对糖尿病视网膜危害更大。

血糖波动；人视网膜色素上皮细胞；炎症

近年研究表明，糖尿病(Diabetic Mellitus，DM)的预后及慢性并发症的发生和发展既与整体血糖水平升高相关，又与血糖波动性关系密切[1]。血糖波动对机体靶器官的损伤已成为DM防治新热点。但对其加重DM急慢性并发症的确切机制尚不完全清楚，尤其是波动性高糖与糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)的研究甚少。本文参照相关文献[2-4]，以5.5mmol/L葡萄糖作为正常对照，以25mmol/L或33mmol/L葡萄糖作为高糖刺激，建立血糖波动模型。通过体外培养人视网膜色素上皮细胞(Human Retinal Pigment Epithelial，HRPE)，检测培养液中炎症反应相关分子如细胞间黏附分子-1 (Intercellular Cell Adesion Molecule-1，ICAM-1)和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)水平，同时平行比较其与持续性高浓度葡萄糖培养后上述两种炎性指标水平的差异，探讨波动性高糖环境下DR发生发展的可能机制，为临床精准控制血糖，防治DR提供初步实验室依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

人视网膜色素上皮细胞株(HRPE D407)，由ATCC公司提供，于液氮中储存。 CO2培养箱 (Thermo Forma 3110系列，北京博奥恒信公司)；胎牛血清、DMEM培养基(含5.5mmol/L葡萄糖，由Hyclone提供)，胰蛋白酶、葡萄糖 (血糖)测定试剂盒(氧化酶法)，均购自北京普利莱基因技术有限公司 ；甘露醇(Solarbio)，ICAM-1 ELISA试剂盒(批号DCD540)购自美国R&D公司，肿瘤坏死因-α(TNF-α) ELISA试剂盒(批号315-01a)购自上海卡努生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HRPE复苏与培养[5]

从液氮中取出HRPE，直接将冻存管投入37℃温水中，并迅速摇动使其尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后拧开管盖，用移液管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后1 000rmp离心10min，除去上清液再用培养基洗一次。用培养基稀释后接种于培养瓶中，于37℃、5% CO2培养箱按常规方法培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。取生长良好的对数期HRPE(2×105/ml)接种于24孔板，待细胞生长至70%-80% 融合状态，再换无血清DMEM培养液培养24h,使细胞同步于G0/G1期。然后用条件培养液再进行实验培养。

1.2.2 条件培养和分组

G0/G1期HRPE分别在不同浓度葡萄糖DMEM培养基中培养，并据此分为四组:(1)低浓度葡萄糖对照培养组(N组)，即用5.5mmol/L葡萄糖培养。(2)不同渗透压对照培养组(P组)，包括25mmol/L渗透压培养组(P1组)，即用5.5mmol/L葡萄糖和19.5mmol/L甘露醇培养；33mmol/L渗透压培养组(P2组)，即用5.5mmol/L葡萄糖和27.5mmol/L甘露醇培养。(3)持续性高糖培养组(H组)，包括25mmol/L葡萄糖持续培养(H1组)和33mmol/L葡萄糖持续培养(H2组)。(4)波动性高糖培养组(F组)，包括25/5.5mmol/L葡萄糖交替培养(F1组，即先用25mmol/L葡萄糖培养3h，再用5.5mmol/L葡萄糖培养基培养2h，日间重复交替3次，25mmol/L高糖过夜)和33/5.5mmol/L葡萄糖交替培养(F2组，即先用33mmol/L葡萄糖培养3h，再用5.5mmol/L葡萄糖培养2h，日间重复交替3次，33mmol/L高糖过夜)。各组均同时换液、培养，共72h，且分别于24h、48h、72h平行收集各组细胞培养上清液，检测其炎性因子水平。

1.2.3 炎性因子ICAM-1、TNF-α含量测定：严格按照两种炎性因子ELISA试剂盒说明书操作和获取结果。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组培养上清液ICAM-1含量比较

各组内不同时间培养上清液ICAM-1水平差异均无统计学意义(P>0.05)。故选取各组24h培养液进行组间方差分析和两两比较。方差分析显示，各组间ICAM-1差异有统计学意义(P<0.01)。两两比较，P1、P2组与N组差异无统计学意义(t值分别为-0.744、0.127，均P>0.05)。H1、H2、F1、F2组较N组升高(t值分别为-5.919、-9.909、-12.299、-14.400，P均<0.01)。各亚组中，P1组与P2组、H1组与H2组、F1组与F2组ICAM-1水平差异均无统计学意义(t值分别为0.789、-1.810、-0.274，P均>0.05)。H1组或H2组明显高于P1或P2组，F1组或F2组显著高于H1组或H2组，差异均有统计学意义(t均>4.121，P<0.01)。见表1。

2.2 各组培养上清液TNF-α水平比较

各组内不同时间培养上清液TNF-α水平差异均无统计学意义(P>0.05)。故选取24h培养液进行组间方差分析和两两比较。方差分析显示，各组间TNF-α差异有统计学意义(P<0.01)。两两比较，P1、P2组与N组差异无统计学意义(t值分别为0.009、0.775，P均>0.05)；H1、H2、F1、F2组较N组升高(t值分别为7.564、-9.460、-16.156、-17.882，P均<0.01)。各亚组中，P1组与P2组、H1组与H2组、F1组与F2组的TNF-α水平差异均无统计学意义(t值分别为-0.281、-0.349、-0.410，P均>0.05)；H1组或H2组明显高于P1或P2组，F1组或F2组显著高于H1组或H2组，差异均有统计学意义(t均>6.075，P<0.01)。见表2。

表1 不同葡萄糖浓度作用不同时间对HRPE培养上清液ICAM-1水平影响均=4)

注：与N组比较，1)P<0.01；与P组比较，2)P<0.01；与H 组比较，3)P<0.01

表2 不同葡萄糖浓度作用不同时间对HRPE培养上清液TNF-α水平的影响均=4)

注：与N组比较，1)P<0.01；与P组比较，2)P<0.01；与H 组比较，3)P<0.01

3 讨论

DM并发症已经成为人类重大公共卫生问题。高血糖可能通过两种方式对DM患者的血管产生病理作用，一种为慢性持续性高血糖，另一种为慢性波动性高血糖。慢性持续性高血糖能够引起DM慢性并发症已经达成共识，较多研究[6-9]均证实持续性高糖刺激可使HRPE的ICAM-1、热休克蛋白47(Heat Shock Protein 47,HSP 47)表达量增加，血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)mRNA和蛋白表达显著增加，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性和还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)表达明显降低，而波动性高血糖环境对DR的研究所见报道甚少，但近年备受关注，成为DM防治研究新热点。本研究通过体外培养HRPE并模拟人体内血糖波动，选取ICAM-1、TNF-α两个炎性指标来观察HRPE在波动性高糖刺激后的炎症表现。

本文结果显示，波动性高糖刺激(不论F1、F2)，均可导致HRPE培养上清液ICAM-1、TNF-α含量增高，且较持续性高糖环境(H1、H2)升高更明显。说明波动性高糖所致炎性损害比持续性高血糖更为严重。这与我们既往观察到的波动性高血糖较持续性高血糖对HRPE产生更严重氧化应激损伤的实验结果[10]相一致，再次从不同侧面验证了血糖波动对机体的危害。

DM是一种自然免疫和低度慢性炎性反应性疾病，细胞因子介导的炎症反应在DM的发病机制中起媒介作用。ICAM-1在炎症发生过程中发挥着非常重要的作用。它是一种跨膜单链糖蛋白，可以作为配体与白细胞表面的淋巴细胞功能相关抗原-1(Lymphocyte Function Associated Antigen-1,LFA-1)结合，使白细胞在多种内皮细胞和上皮细胞上黏附而参与机体的炎症反应，若其诱导白细胞在视网膜附着和活化，可引起视网膜微血管渗出等炎症改变[11]，成为早期DR发生和发展的关键性因素。正常机体细胞通常较少表达或者不表达ICAM-1，而DM患者，视网膜细胞的ICAM-1表达量较正常健康人群明显增加[12,13]。TNF-α是一种多功能炎性细胞因子，其正常水平对机体有利，过量则可作为炎性介质引起炎症损伤和免疫抑制效应。于书静等[14]研究表明，DM大鼠视网膜组织中存在TNF-α表达量增加，储俐等[15]临床发现DR病人血清 TNF-α表达水平较正常人显著升高。所以认为ICAM-1和TNF-α是增殖期DR密切相关的细胞因子。通过检测视网膜组织和血液中这两种炎性因子水平可为临床诊断DR或监测血糖控制起到重要作用。

本实验中，我们设置了渗透压对照组，以排除渗透压对高糖作用的影响。结果发现25mmol/L和33mmol/L渗透压对照组的ICAM-1与TNF-α水平与正常对照组无统计学差异。提示引起HRPE炎性损伤的是高糖而非高渗透压。

综上所述，波动性高糖较持续性高糖危害更大，可加剧机体的炎症反应，加剧DR的发生和发展。加强对血糖波动的关注，制定精准降糖方案，消峰去谷，减少血糖波动，全面阻断炎症反应链条，可能成为DM并发症临床防治新的干预策略。

本文第一作者简介：

李立琴(1984-)，女，汉族，硕士研究生，研究方向为糖尿病并发症

1 陈名道. 波动性高血糖与糖尿病并发症[J]. 国际内分泌代谢杂志,2006, 26(5):312-314.

2 王景尚,黄 烨,陈水龄,等.洋参二醇皂苷对波动高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护效应研究[J].现代中西医结合杂志,2017,26(5):457-460.

3 唐甜甜,郭立新,潘 琦,等.胰高血糖素样肽1通过调控葡萄糖调节蛋白78表达改善高糖及波动性高糖诱导的内皮细胞内质网应激及凋亡[J].中华糖尿病杂志,2015,7(11)：684-688.

4 孙连庆,王 煊,李晓瑾,等.丹参酮ⅡA抑制波动性高糖诱导的雪旺细胞凋亡的观察[J].中国糖尿病杂志,2015,23(11)：1 027-1 031.

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10 李立琴,苏胜偶,徐丽丽.波动性高糖与持续性高糖对人视网膜色素上皮细胞氧化应激的影响[J].中华糖尿病杂志,2011,3(5)：406-409.

11 李春深,苗 戎,蔡 青,等.ICAM-1和VCAM-1在糖尿病视网膜病变中的作用[J].国际眼科杂志,2012,12(1):1-3.

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14 于书静,王 康,李 娜,等.Toll样受体4及相关炎性细胞因子在糖尿病大鼠视网膜中的表达[J].中华眼底病杂志,2014,30(2):175-179.

15 储 俐, 王转丽,李官鸿,等. 增殖期糖尿病视网膜病变与血清TNF-α表达的相关性研究[J]. 中医眼耳鼻喉杂志, 2016, 6(1):16-17.

Impact of Intermittent High Glucose on Pro-inflammatory Cytokines Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells

LI Li-qin1, ZHANG Yun-liang1，*, GUO Shu-qin1, WANG He1，JIN LI-li2，DONG Yue-hua1，XIN Huan-huan，LIU Li-fang1.

1Department of Endocrinology；2Departmont of Cardiology，The First Central Hospital of Baoding, Baoding 071000，China

Objective: To investigate the inflammatory injury of human retinal pigment epithelial(HRPE) cells to persistent high glucose and fluctuant high glucose.Method: HRPE cells were cultured under standard conditions ,serum-starved for 24 hours and then were randomly divided into four groups: normal glucose control group (5.5mmol/L glucose, N),osmotic pressure group(19.5 mmol/L mannitol plus 5.5 mmol/L glucose， 27.5 mmol/L mannitol plus 5.5 mmol/L glucose，P1and P2)， constant high glucose group (25mmol/L glucose and 33mmol/L glucose, H1and H2), fluctuant high glucose group (25mmol/L or 33mmol/L glucose for three hours, at an interval of two hours of 5.5mmol/L glucose, such intermittent exposure was repeated three times a day and the cells were exposed to 25mmol/L or 33mmol/L glucose in the night, F1and F2). Concentration of tumor necrosis factor ( TNF) -α and intercellular adhesion molecule-1 ( ICAM-1) in every group in the supernatant were measured by use of ELISA in 24 hours,48 hours, and 72 hours according to the instructions.Results: There was no significant difference for each index in every group at different times (P>0.05).There was no significant difference for each index between the osmotic pressure group and the normal glucose group (P>0.05) at any moment.Compared with the normal glucose group, the level of ICAM-1 and TNF-a in the constant high glucose group and the fluctuant high glucose group both increased (P<0.01, respectively)， the fluctuant high glucose group significantly increased than the constant high glucose group with a marked increase of ICAM-1 and TNF-α(P<0.01, respectively).There was no difference between the 25mmol/L and 33mmol/L high glucose groups,also there was no difference between the two fluctuant high glucose groups.Conclusion: Fluctuant high glucose evoked more intense inflammatory damages than constant high glucose,it was more harmful to the diabetic retinopathy.

Fluctuant high glucose; Human retinal pigment epithelial cell; Inflammation

河北省保定市第一中心医院，保定 071000 ；1内分泌一科；2心内五科；*

，E-mail：zhangyunliangnfm@sina.com

本文2017-03-06收到，2017-06-23修回

R587.2

A

1005-1740(2017)03-0022-05