结直肠癌组织乳脂肪球表皮生长因子8蛋白表达与临床病理特征和患者生存率的关系*

陈 超 任 俊 朱建华 贾 珉，#

结直肠癌组织乳脂肪球表皮生长因子8蛋白表达与临床病理特征和患者生存率的关系*

陈 超1任 俊2朱建华1贾 珉1，#

目的：探讨乳脂肪球表皮生长因子8(MFG-E8)蛋白在结直肠癌(CRC)组织中的表达及其与临床病理特征和患者生存率的关系。方法：留取手术切除CRC癌组织(CRC组)及相应癌旁组织(Control组)各88例，应用免疫组织化学法(SP法)检测癌组织及癌旁组织MFG-E8蛋白表达，统计分析各组MFG-E8蛋白高表达率的差异，以及CRC组中MFG-E8低表达组、阳性表达组和强阳性表达组患者临床病理因素和总生存率的差异。结果：CRC组癌组织MFG-E8蛋白高阳性表达率为73.86%(65/88)，显著高于Control组28.41%(25/88)(P<0.01)。MFG-E8蛋白表达强度仅与淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者年龄、临床T和M分类、临床分期及肿瘤分型无显著相关(P>0.05)；MFG-E8阴性表达组及强阳性表达组患者总生存率均显著低于阳性表达组(P<0.01)。结论：MFG-E8在CRC患者癌组织中阴性表达及强阳性表达均可促进CRC的淋巴结转移，并提示预后较差。

结直肠癌；乳脂肪球表皮生长因子8；预后

结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率在国内呈逐年上升趋势，严重影响着国民健康[1]。肿瘤细胞侵袭转移难以治疗。其侵袭转移过程包含癌细胞的黏附、运动、基质降解和新生血管形成等环节。乳脂肪球表皮生长因子8(MFG-E8)是一种存在于多种物种体内的亲脂性多效糖蛋白，可促进吞噬性清除凋亡细胞，维持正常组织稳态[2]。目前，其与肠道癌症方面的作用，如与CRC的关系尚不清楚。本文应用免疫组织化学法测定MFG-E8在CRC组织的表达情况，分析其与CRC临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源及分组

收集2006-07-2009-05武汉市第一医院病理确诊的结直肠癌手术切除癌组织(CRC组)及癌旁组织(Control组)各88例。CRC患者中男47例，女41例。年龄24-90岁，中位年龄71岁。按1992版Dukes分期标准进行临床分期：1 期8例，2期48例，3期30例，4期2例。要求术前未做放化疗，术后行以氟尿嘧啶为主的方案化疗并随访，随访截止日期为2014-08 CRC组依据癌组织中MIG-E8强度分为3个亚组，即阴性表达组、弱阳性+阳性表达组(阳性表达组)和强阳性表达组。

1.2 主要试剂

鼠抗人MFG-E8多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司(SC-8029)，链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒购自上海长岛公司(B1012)，抗体稀释液、 DAB显色剂购自美国DAKO公司(GT100920、002948)。

1.3 SP染色及结果判读

1.3.1 SP染色：4μm 厚石蜡切片常规脱蜡、水化，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶10min，微波炉加热修复抗原3min，加一抗(MFG-E8 1∶50 稀释)4℃冰箱过夜，加二抗37℃ 10min，DAB 显色，苏木精复染，脱水透明封片，以抗体稀释液代替一抗做阴性对照,以已知阳性的胃癌组织免疫SP染色切片作为阳性对照。

1.3.2 结果判定：细胞浆中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达细胞。染色后，10×40高倍视野下，随机选取4个视野，先行三方面染色情况评分[3]：(1)着色：无染色，0 分；淡黄色，1 分；棕黄色，2 分；棕褐色，3 分。(2)染色阳性细胞百分比：无阳性细胞，0 分；<10%，1 分；10%-50%，2 分；50%-90%，3 分；≥90%，4 分。(3)染色方式评分：无染色，0 分；散在染色，1 分；局灶染色，2 分；弥漫染色，3分。再按以上3项评分的乘积判断阳性表达强度。≤4分为阴性(-)表达；5-8 分为弱阳性(±)表达，9-18 分为阳性(+)表达，19-36 分为强阳性(+++)表达，见图1。以上结果均至少由两位病理科医生以盲法观察确定。

图1 CRC组和Control组MFG-E8蛋白各种表达强度(SP，×400)

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件。计数资料用百分率(%)表示，组间比较用χ2检验，相关性分析用Spearman，生存率分析应用Kaplan-meier法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC组与Control组MFG-E8蛋白表达强度比较

统计分析以阴性表达+弱阳性表达为低表达，阳性表达+强阳性表达为高表达。CRC组MFG-E8高表达率明显高于Control组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 MFG-E8在CRC组织及癌旁组织中的表达情况(n，%)

注：与Control组比较，1)P<0.01

2.2 CRC组MFG-E8蛋白表达强度与临床病理因素分析

从表2可见，MFG-E8蛋白表达强度仅与淋巴结转移(N分类)相关(P<0.05)，MFG-E8蛋白表达强度与其它临床病理特征：年龄、T分类、M分类、临床分类、肿瘤分型均无关(P>0.05)。

表2 MFG-E8蛋白表达强度与临床病理特征的关系

2.3 CRC组MFG-E8蛋白表达强度与患者生存率分析

CRC组不同MFG-E8蛋白表达强度患者总生存率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。阴性表达组和强阳性表达组患者总生存率均明显短于阳性表达组患者(P<0.01)，而阴性表达组与强阳性表达组患者总生存率差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 CSC患者癌组织MFG-E8蛋白不同表达强度者生存曲线

3 讨论

MFG-E8蛋白于1990年在哺乳动物的乳腺中被首先发现[4]，是一种分泌型的多效糖蛋白, 分子量约为53kDa，其基因位于人类15号染色体。有研究表明，MFG-E8在多种肿瘤细胞上表达，如恶性黑色素瘤[5]、甲状腺癌[6]、乳腺癌[7,8]等，并对预后有一定影响。但其在肠道肿瘤如CRC的表达及与病理因素和预后的关系少有报道。

本研究中CRC患者癌组织MFG-E8蛋白高表达率为73.86%，显著高于癌旁组织28.41%，提示高表达的MFG-E8蛋白可能参与CRC的发生和发展机制。同时, MFG-E8蛋白强阳性表达仅与病理因素中淋巴结转移显著相关，而与年龄、T分期、临床分期、肿瘤分型之间无明显关系，表明MFG-E8蛋白在结肠癌组织中的高表达可以促进肿瘤淋巴结转移，(M分类由于M1数量太少，而无法获得有意义的统计学数据)，而且MFG-E8蛋白强阳性表达组患者总生存率低于阳性表达组，这与已有文献报道[6,8]对其它肿瘤研究的结果相近。

肿瘤细胞转移不仅与肿瘤自身特性有关，还与肿瘤所处微环境稳定性密不可分。合适强度的MFG-E8表达，在吞噬细胞和肿瘤细胞之间起桥连作用，MFG-E8蛋白既与肿瘤细胞外翻的磷脂酰丝氨酸结合，同时与吞噬细胞的αvβ3/αvβ5整合素受体结合，导致整合素构象变化，通过CrkⅡ-DOCK180-Rac1复合物活化Rac1,使吞噬细胞的细胞骨架发生重组，促进吞噬细胞吞噬肿瘤细胞[10,11]，维持机体内环境稳定，减少或阻止肿瘤细胞侵袭转移。但MFG-E8蛋白过度表达可能不利于两细胞间的桥连，引起吞噬障碍，阻止机体对肿瘤细胞的吞噬清除及炎症反应，增加肿瘤细胞的侵袭力[12]。因而出现MFG-E8表达增强时，机体对肿瘤细胞的吞噬清除发生障碍，加快肿瘤的侵袭和转移，导致患者预后较差。

本文结果还表明CRC患者MFG-E8阴性表达组与患者临床病理特征和总生存率的关系与强阳性组表现相同，即MFG-E8阴性表达仅与CRC患者淋巴结转移有关，且总生存率显著低于阳性表达组。 推测其原因可能由于MFG-E8阴性表达时，没有足够数量的MFG-E8作为αvβ3和αvβ5整合子的配体，来介导黏着蛋白的聚集以及细胞内的信号级联反应起始过程[13]，导致在吞噬细胞和肿瘤细胞之间建立桥连作用不足，降低了机体对肿瘤细胞的清除能力，导致CRC患者预后较差。

综上所述，检测CRC患者癌组织中MFG-E8蛋白的表达水平，可预测患者预后，并为个体化治疗提供重要的理论依据。

本文第一作者简介：

陈 超(1984-)，男，汉族，硕士，主要从事肿瘤免疫学诊断工作

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2 Ensslin MA, Shur BD. The EGF repeat and discoidin domain protein, SED1/MFG-E8, is required for mammary gland branching morphogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007，104(8):2 715-2 720.

3 李杰宝，张家衡，乳脂肪球因子8在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义[J].中华实验外科杂志，2015，32(7)：1 666-1 668.

4 Stubbs JD, Lekutis C, Singer KL, et al. cDNA cloning of a mouse mammary epithelial cell surface protein reveals the existence of epidermal growth factor-like domains linked to factor VIII-like sequences[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1990，87(21):8 417-8 421.

5 Oba J, Moroi Y, Nakahara T, et al. Expression of milk fat globule epidermal growth factor-VIII may be an indicator of poor prognosis in malignant melanoma[J]. Br J Dermatol，2011，165(3): 506-512.

6 Huang Y, Prasad M, Lemon WJ, et al. Gene expression in papillary thyroid carcinoma reveals highly consistent profiles[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(26):15 044-15 049.

7 冯先华，李金丽，崔天盆. 血清MFG-E8与CA153、CEA水平对乳腺癌诊断价值的探讨[J].中国实验诊断杂志，2012，16(4)：618-620.

8 Tibaldi L, Leyman S. New blocking antibodies impede adhesion, migration and survival of ovarian cancer cells, highlighting MFGE8 as a potential therapeutic target of human ovarian carcinoma[J]. PLoS One, 2013，8(8):e72 708.

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10 Komura H, Miksa M, Wu R, et al. Milk fat globule epidermal growth factor-factor VIII is down-regulated in sepsis via the lipopoly -saccharide-CD14 pathway[J].J Immunol, 2009，182(1):581-587.

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12 Lauber K, Keppeler H, Munoz LE,et al. Milkfat globule-EGF factor 8 mediates the enhancement of apoptotic cellclearance by glucocorticoids[J].Cell Death Differ, 2013，20(9):1 230-1 240.

13 Motegi S, Leitner WW, Lu M, et al. Pericyte-derived MFG-E8 regulates pathologic angiogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011,31(9):2 024-2 034.

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CNKI研制成功《医院科研成果统计分析与评价数据库》，日前通过专家鉴定

2017年7月20日，同方知网(CNKI)中国科学文献计量评价研究中心研发的《医院科研成果统计分析与评价数据库》召开了专家鉴定会。来自卫生和医疗主管部门、医院科研处、学协会等18个单位的20位专家参会，并对该项成果给予高度评价，认为其达到国内领先水平。

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该数据库为医院科研绩效评价与管理提供了丰富、全面的统计数据。基于"科研结果管理"的理念，该数据库发布了大量客观事实数据。主要用途可以概括为：首先，支持医院的学科发展水平评价。既能纵向比较各年各学科发展趋势，又能横向与全国同学科医院发展水平进行对比分析，从而知彼知己，找准医院学科建设的重点方向。其次，支持专家学者评价。该数据库对医院科研人员近10年的科研产出和学术影响力进行了全面统计分析，方便医院了解和管理本院各科室学者，也方便评估和寻找学科带头人和专家。第三，支持学者成果的快捷汇总和统计，把科研人员从整理自己成果的繁琐工作中解放出来。只需轻轻一点，即可轻松完成了科研成果及影响力数据的统计和导出！

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Study on the Correlation between MFG-E8 Protein Expression with Clinicopathological Features and Survival in Colorectal Cancer

CHEN Chao1, REN Jun2, ZHU Jian-hua1, JIA Min1,#

1Department of Clinical Laboratory;2Department of Surgery,Wuhan First Hospital, Wuhan 430030,China;#

Objective: To explore the expression of milk fat globule EGF factor Ⅷ (MFG-E8) in colorectal cancer (CRC) tissues and the correlation with clinicopathological features and survival in CRC patients.Method: 88 CRC-related cases with follow-up information were made into tissue microarrays according to the paired principle of cancer tissues and the adjacent tissues. The expression of MFG-E8 was detected with immunohistochemical analysis and SPSS software was finally utilized to analyze the relationships between experimental data and clinical indicatives.Results:MFG-E8 expression increased significantly in colorectal cancer compared with normal mucosa tissues(control group) (P<0.01). In addition, both strong positive and negative expression of MFG-E8 were correlated with lymph node metastasis (P<0.05). Furthermore, patients with strong positive or negative expression of MFG-E8 showed shortened overall survivals (P<0.01),compared with patients with weakly positive and positive expression of MFG-E8.Conclusion: Both strong positive expression and negative expression of MFG-E8 might be involved in the progression of CRC and they were associated with patients' poor overall survivals.

Colorectal cancer;Milk fat globule-epidermal growth factor 8; Prognosis

武汉市卫计委课题(武卫2007-43号)

武汉市第一医院，武汉 43000;1检验科；2外科；#

,E-mail:Pollyann@126.com

本文2017-04-03收到，2017-07-16修回

R735.3

A

1005-1740(2017)03-0038-05