重组链激酶粗提工艺研究

2017-08-27赵素娟翟佳慧

临床医药文献杂志(电子版) 2017年27期

关键词：粗品菌体纯度

赵素娟，翟佳慧

（青岛国大生物制药股份有限公司，山东青岛 266510）

·基础研究·

重组链激酶粗提工艺研究

赵素娟，翟佳慧

（青岛国大生物制药股份有限公司，山东青岛 266510）

目的研究重组链激酶得粗提工艺。方法 SKg基因采用PCR方法从G群β-溶血型链球菌基因中扩增获得，将此基因转至pBV220中形成pBV-SKg，再将其转到大肠杆菌中形成稳定的工程菌，经过增菌，破菌，粗提，纯化得到重组链激酶。粗品的量及纯度将影响重组链激酶收率，本文通过改变洗涤包涵体的尿素浓度，提高重组链激酶粗品的重量，从而提高了重组链激酶的收率。结果重组链激酶菌体经洗涤，酶解，得到重组链激酶包涵体沉淀。将包涵体沉淀分别用不同浓度的尿素-TE洗涤、离心、收集沉淀，将沉淀做SDS-PAGE检测，结果1M尿素-TE洗涤效果较好，且包涵体重量高。结论从SDS-PAGE检测结果上分析，1.0M尿素-TE洗涤的效果重组链激酶纯度和粗品重量更高一些，本试验的研究为提高重组链激酶的收率提供了实验依据。

链激酶；粗提；缓冲剂；洗涤；包涵体

链激酶（Streptok inase，SK）是世界上最早发现的纤维蛋白酶原激活剂，也是最早作为临床药品治疗血栓性疾病的溶栓酶[1,2]。它是由A，C，G群链球菌中β-溶血性链球菌分泌的胞外非酶蛋白质，能和纤溶酶原结合，将纤溶酶原激活为纤溶酶，血纤维蛋白酶原（plasminogen，Pg）最有效的活化剂之一，具有溶解血栓的作用。

1 材料与准备

1.1 菌种特性

SKg基因采用PCR方法从G群β-溶血型链球菌基因中扩增获得，将此基因转至pBV220中形成pBV-SKg，再将其转到大肠杆菌中形成稳定的工程菌，表达水平为链激酶表达量占菌体总蛋白的30%左右。本工程菌在LB培养基的平板上培养，连续传代在50代以上，表达水平稳定。

1.2 种子批的建立

从原始种子批传代和扩增后，冻干保存的菌种称为主种子批，由主种子传代和扩增后的菌种称为工作种子批。

主种子批的建立：从原始菌种传出，扩大培养后冻干保存的菌种称为主种子批，由此传出的菌种供生产用。但每次只限传三代。

工作种子批的建立：取检定合格的主种子批冻干菌种，溶解后，在含有Amp的LB培养基上划线，30℃培养24-48小时至单菌落长至半径3mm左右，表现为典型的大肠杆菌菌落形态，无其他杂菌生长。

挑取单菌落划斜面扩大培养，同时接种至LB培养基中，进行模拟发酵和菌种检定。检定合格的菌种，做为生产用菌种（工作种子批）。

菌种检定：主种子和工作种子均应做如下检定，合格后方可使用。

划线LB固体琼脂平板上，表现为典型大肠杆菌菌落形态，无其它杂菌生长。

涂片作革兰氏染色，在光学显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌。

对抗生素的抗性应与原始菌株相同，具有氨苄青霉素（Amp）抗性，能在含Amp的LB液体或固体培养基中生长。电镜检查应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。（至少每年外出检查一次、工作种子免做）生化反应应符合大肠杆菌生物学性状。提取质粒做酶切图谱检查，应含有rSK基因片断。（至少每年外出检查一次）将诱导后的工程菌进行电泳分析，rSK的表达量约占菌体总蛋白的30%左右。目的基因核苷酸序列检查应与批准的序列相符。

1.3 种子液制备

检定合格的工作种子批，接种在含有Amp的LB培养基中，摇床30℃振荡培养16小时，即为一级种子液。其OD600为0.6-1.0。

1.4 增菌

将一级种子液按5%（体积比）接种至M9CA培养基中，摇床30℃振荡培养13-16小时，即为二级种子液，OD600为1.2～2.0。涂片作革兰氏染色，在光学显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌。制备好的二级种子液常温下10小时内使用，冷藏保存条件下（4℃左右），24小时内使用。

1.5 初步纯化

采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，即为重组链激酶粗品，纯度为60%左右。

1.6 高度纯化

经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，280nm检测下收集rSK蛋白峰，收集rSK蛋白纯度在95%以上，即为重组链激酶原液[3,4]。