优质奶啤乳源酵母菌的筛选及发酵性能的研究

胡曼，王亮，巩小芬，王江月，刘朋龙，詹涛，李阳

（1.江苏大学食品与生物工程，江苏镇江212013，2.新疆天润生物科技股份有限公司，乌鲁木齐830088)

优质奶啤乳源酵母菌的筛选及发酵性能的研究

胡曼1，王亮1，巩小芬1，王江月1，刘朋龙2，詹涛2，李阳2

（1.江苏大学食品与生物工程，江苏镇江212013，2.新疆天润生物科技股份有限公司，乌鲁木齐830088)

以新疆乌鲁木齐地区采集的开菲尔粒作为分离源，进行了乳源酵母的分离、优质奶啤乳源酵母的筛选和发酵性能的研究工作。对分离的乳源酵母菌进行了发酵产物理化指标分析、遗传稳定性的检测和发酵产品感官、风味的分析，最后通过主成分分析法对不同乳源酵母菌发酵奶啤的特征进行综合评价。结果表明，在分离得到的17株乳源酵母菌中，酵母菌MJ1发酵24 h后，满足奶啤工业理化和卫生标准的要求，酒精生成量为3.88 g/L，发酵产品理化、感官和风味的主成分分析的评价结果最佳，遗传稳定，适宜奶啤生产发酵，经鉴定此酵母菌为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。

奶啤；乳源酵母菌；筛选；固相微萃取-气相色谱-质谱法；主成分分析；鉴定

0 引言

奶啤是以全脂乳或脱脂乳为原料，经乳酸菌、酵母发酵制成的一种新型乳饮料[1]，属国内外首创[2]，一经上市就成为广大消费者的新宠。酵母菌在发酵时能产生蛋白水解酶、水溶性维生素、游离氨基酸等物质[3-5]，提高了奶啤的风味和质量。

奶啤的风味和质量与使用的酵母菌种息息相关，当前，大多数奶啤企业仍使用市售酿酒酵母生产奶啤，口味雷同，品种单一[1]；生产时添加大量酒花、麦芽，工艺复杂，成本偏高。因此，为解决问题，科研人员将目光投向了乳源酵母菌种，期待从自然界或农牧民发酵乳制品中寻找新的酵母菌株作为发酵替代菌株[6]。

研究以开菲尔粒作为菌种分离源，逐级进行乳源酵母菌的筛选和发酵功能分析，以期为奶啤的生产提供优质乳源酵母菌。

1 实验

1.1 材料与试剂

开菲尔粒，新疆乌鲁木齐地区采集；乳酸菌（保加利亚乳酸杆菌、嗜热链球菌），江苏大学食品学院实验室保存；脱脂乳粉、白砂糖、脱脂奶，复合稳定剂，市售。

琼脂糖、酵母浸粉、胰蛋白胨、葡萄糖、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、氢氧化钠、体积分数95%乙醇等分析纯；色谱纯无水乙醇，琼脂糖，PCR buffer，dNTP，溴化乙锭，TE缓冲液，酵母菌基因组抽提试剂盒。

1.2 培养基

YGC琼脂培养基（含氯霉素），YPD液体培养基，酸化MRS肉汤培养基，M17培养基，平板计数琼脂培养基，马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基，孟加拉红培养基。

发酵培养基(实验室配制)：酸乳30%，白砂糖7%，复合稳定剂0.5%，95℃灭菌5 min。

1.3 仪器与设备

SW．J．2FL洁净工作台，气相色谱-质谱联用仪HP6890/5973，顶空固相微萃取SPMC-57328，MyCy⁃cler PCR仪，Universal Hood凝胶成像仪，PowerPacD⁃NA电泳仪，气相色谱仪(GC-5890 HP)，毛细管柱(Ag⁃ilent 1909/N.133HP.1NNOWAX,30m×0.25mm)。

1.4 方法

1.4.1 乳源酵母菌的分离、纯化

将采集的开菲尔粒样品，按照3%的接种比例接种到灭菌脱脂乳中，30℃、140 r/min摇瓶培养24 h。重复两次后，按照Jun-Jun Yang等人[7]的方法进行乳源酵母菌种的选择性分离和纯化。

1.4.2 发酵菌种的活化、扩培及制备

1.4.3 优质奶啤乳源酵母菌的筛选

（1）乳源酵母菌的初筛。将活化后的乳源酵母菌以3%的体积分数接种于发酵培养基中，按照奶啤生产工艺进行发酵。参考GB19302-2010中发酵乳的理化和卫生标准的测定方法，对发酵乳的理化指标及卫生指标进行测定。优选符合奶啤生产标准的乳源酵母菌。

（2）乳源酵母菌的复筛。将初筛得到的酵母菌进行传代培养，连续传代5代，观察细胞形态并测定每代菌株发酵培养后的酒精度，筛选出酒精度适宜且产量稳定的菌株。

（3）乳源酵母菌的三次筛选。复筛得到的酵母菌株接种于发酵培养基中，按照奶啤生产工艺进行发酵。对发酵产品进行感官评定和挥发性风味测定，并进行主成分分析，筛选出发酵风味优良的乳源酵母菌。

1.4.4 酵母菌分子生物学鉴定

筛选到的优质乳源酵母菌采用5.8S rDNA鉴定法进行分子生物学鉴定。实验以样品总DNA为模板，利用聚合酶进行PCR反应。PCR扩增结束后，将扩增产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳液为1×TAE。电泳后，EB染色15-20 min，紫外光下观察，拍照。

回收扩增好的PCR产物，进行序列测定。将序列在GeneBank核酸数据库中进行同源序列Blast比对，检测序列同源或亲缘关系相近的相关酵母菌的信息，以确定优选菌株的菌属和GenBank菌种序列号。优选菌株序列BLAST比对后，选取5条相似性较高序列(相似性系数＞96%)，运用软件MEGA5.05进行系统发育分析。

1.4.5 工艺流程[1]

（1）制备酸乳

（2）制备奶啤

1.4.6 操作要点

（1）温度。酸乳制备的温度应控制在42～44℃，奶啤的发酵温度控制在28～30℃。

（2）预热。预热温度是60～70℃，目的是提高蛋白的热稳定性。

（3）均质。白砂糖和复合稳定剂需在70℃干拌匀，均质压力15～20 MPa，使产品口感细腻，提高稳定性。

（4）杀菌。奶啤的制备采用95℃条件下杀菌5 min，成品后杀菌条件为70℃，15 min。

（5）冷藏和后熟。酸奶后熟的温度为4～6℃，奶啤成品冷藏温度4～6℃。

1.4.7 优选酵母菌株代谢物指标的测定

酒精度采用气相色谱法[8]进行；滴定酸度的测定采用GB5413.34-2010中的方法；挥发性成分检测采用SPME-GC/MS中的分析方法[9]；质量指标的测定采用GB19302-2010中方法进行；奶啤的感官评定：由10名受过感官鉴定的小组成员进行感官评定，主要评定项目参照表1[10]。

2 结果与讨论

2.1 乳源酵母菌的分离、纯化和形态学鉴定

表1 感官评定细则

表2 酵母菌形态学鉴定结果

经过酵母菌选择培养基筛选培养，酵母菌形态学鉴定，初步获得17株酵母菌。对17株酵母菌编号后进行形态学描述，结果如表2所示。

由表2可以看出，从酵母菌的颜色、湿润度、光滑度、菌落形态、透明度、边缘这6个方面可将17株酵母菌大致分为4类：①NJ1，NJ2，NJ3，NJ4，NJ5和NJ6 6株酵母菌形态相似，乳白色、圆形，菌落表面湿润、光滑、半透明，边缘整齐。②MJ1，MJ2，MJ3和MJ4 4株酵母菌为乳白色、圆形，表面较干燥、光滑、不透明，边缘整齐。③BJ1，BJ2，BJ3，BJ4，BJ5和BJ6 6株酵母菌形态为乳白色，表面干燥、多凸起、不透明，边缘不整齐。④YJ1酵母菌为白色、圆形，菌落表面湿润、光滑，透明，边缘整齐。

2.2 奶啤乳源酵母菌的筛选

2.2.1 乳源酵母菌的初筛

理化指标和卫生指标是产品工业化生产的重要质量指标。对17株乳源酵母菌发酵乳品中蛋白质、总固形物、pH、菌落总数、大肠菌群、霉菌、酵母菌数进行测定，测定结果如表3所示。

由表3可以看出，以李新玲[1]和其其格[11]奶啤生产的理化指标（蛋白质≥0.8%，总固形物≥8%，pH≤4.4，酒精度≤2.5%(体积分数)）和卫生指标（菌落总数≤1×104mL-1；大肠菌群(最近似值)≤0.30mL-1；霉菌≤30 mL-1；酵母菌≤50 mL-1）为对照标准。在蛋白质和总固形物含量方面，除了酵母菌MJ3，几乎所有的酵母菌都能满足蛋白质≥0.8%，总固形物≥8%要求；在pH值方面，可能由于NJ2，NJ3，NJ4，NJ5，MJ3，BJ1，BJ2，BJ3，BJ4，BJ5和BJ6这几类酵母菌发酵乳糖产生的乳酸过多[6]，导致pH值大于4.4，使之不符合生产标准；在乙醇体积分数方面，所有的乳源酵母菌都符合低于2.5%(体积分数)[12]生产指标要求，达到奶啤饮料的生产标准；在大肠杆菌数和霉菌数方面，所有的乳源酵母菌都能满足生产要求；在总菌落数和酵母菌数方面，MJ4不符合标准。因此，综合乳源酵母菌分析测定结果，5种乳源酵母菌NJ1，NJ6，MJ1，MJ2和YJ1满足进一步复筛要求。

2.2.2 乳源酵母菌的复筛

为检测复筛菌株的遗传稳定性，将5株乳源酵母菌菌株连续传代5次，观察每次传代后菌株的菌落特征和测定每次传代后菌株发酵产物乙醇含量的变化，结果如表4所示。

由表4可以看出，菌株NJ1和菌株YJ1在第4代时细胞的边缘逐渐变为不规则，乙醇体积分数下降，说明这两株酵母菌稳定性较差。菌株NJ6，MJ1和MJ2经过5次的传代，菌落形态保持稳定，个体形态正常，无变异、变形，乙醇产量稳定，表明菌株遗传稳定性良好。因此，选择NJ6,MJ1和MJ2这3株酵母菌作为第三次菌株复筛对象。

2.2.3 乳源酵母菌的第三次筛选

2.2.3.1 感官评定分析

酵母菌株直接决定奶啤发酵的口感及风味，是奶啤乳饮品发酵的“灵魂”。为获得发酵产品风味较好，口感层次丰富的乳源酵母菌菌株，需对第三次复筛菌株的发酵产物进行感官评定和挥发性成分测定。按照表1评定规则（颜色、味道、组织形态、气味、气泡和总体评价）对3株乳源酵母菌菌株发酵产物进行感官评定，实验设置未接种酵母菌的相同发酵底物作为空白对照，结果如表5所示。

在发酵样品的颜色方面，由表5可以看出，MJ1（4.4）和MJ2（3.6）与空白组（2.9）差异显著，这意味着，这两个菌株能显著影响奶啤的颜色。NJ6酵母菌颜色感官分值高于空白组，但是无显著性差异。在发酵样品的味道方面，所有的酵母菌发酵味道都显著性优于空白组，MJ1分数最高，表明MJ1酵母菌能显著性影响奶啤的味道。在发酵样品的组织形态（乳液均一性、黏稠度、乳清析出等）方面，MJ1（4.6）显著性高于空白组（3.7），表明MJ1能提高奶啤的组织形态。在气味（芳香性、醇味、奶香等）方面，MJ1的感官值是4.2分，显著高于空白组的2.5分，表明MJ1能提高奶啤的风味。在气泡方面，MJ1（3.7）气泡含量与空白组（2.7）差异显著，明显高于空白组，MJ2（3.2）和NJ6（2.9）之间差异不显著。

表3 发酵液质量指标测定结果

表4 乳源酵母菌传代次数对菌落特征和乙醇代谢的影响

如表5所示，感官评定小组给出的感官分值表明，MJ1显著影响发酵样品的颜色，味道，组织形态、风味和气泡含量。

2.2.3.2 挥发性成分分析

利用GC/MS（固相微萃取-气相色谱-质谱法，solid-phase micro-extraction–gas chromatography–mass spectrometry）对第三次筛选的3株酵母菌发酵的奶啤进行挥发性成分检测，实验设置未接种酵母菌的相同发酵底物作为空白对照，实验数据中匹配度高于70的挥发性物质作为有效实验鉴定结果[13]。结果如表6所示。

由表6可以看出，奶啤发酵产品中的风味成分主要是醇类、酯类、酮类、酸类和醛类等物质，与杨红敏[9]和张志国等人[14]研究类似。空白酸奶样品的香气组成有醛类1种，相对质量分数为0.36%；醇类1种，相对质量分数为1.46%；酯类3种，相对质量分数为32.58%；酮类1种，相对质量分数为1.69%。MJ1发酵样品中含醛类有5种，相对质量分数约为1.54%；醇类3种，相对质量分数约为9.85%；酯类6种，相对质量分数约为18.29%；酮类1种，相对质量分数约为0.14%，酸类2种，相对质量分数约为1.5%。MJ2发酵样品中含醛类3种，相对质量分数为1.64%；醇类3种，相对质量分数为6.36%；酯类1种，相对质量分数为13.08%。NJ6发酵样品中含醛类2种，相对质量分数为0.59%；醇类2种，相对质量分数为4.92%；酯类6种，相对质量分数为15.87%；酮类1种，相对质量分数为0.53%；酸类3种，相对质量分数为9.99%。

乳饮品中的风味化合物主要是由微生物产生的酶类，通过分解乳品中蛋白质、脂肪和糖类等物质而产生的[15]。从表6综合比较分析结果来看，空白样品香气成分主要由乙酸乙酯构成，有强烈的醚似的气味，清灵、微带果香的酒香，易扩散，不持久。而其余3种酵母菌形成的奶啤样品中挥发性成分较丰富，醇类和醛类等物质种类远远高于空白样品。

多数醇类阈值较高，但不少醇类能够呈现酒香或者植物清香味，同时醇类和有机酸类可以发生酯化反应，还会形成极少量的醛类、酮类等重要的风味物质和风味辅助物质，间接对风味产生影响。由表6可知，发酵样品中的醇类主要有乙醇、3-甲基丁醇和苯乙醇等。3-甲基丁醇具有较低的检测阈值[16]，可能由3-甲基丁醛降解形成[17]，有苹果白兰地香气和辛辣味，国标GB2760-86将其规定为可以使用的食用香料。苯乙醇天然存在于苹果、香蕉杏仁、桃子等植物中，也是国标允许使用的食用香料。由表6可以看出，3种乳源酵母菌发酵产品中醇类物质的种类和含量都明显高于空白样品；而在3种乳源酵母菌发酵样品比较分析中，MJ1和MJ2醇类种类以及相对质量分数都多于NJ6。醇类物质及其相对含量是影响奶啤芳香特性及风味的主要原因[9]，结果分析证明，MJ1和MJ2优于NJ6。

表6 4种发酵样品中挥发性成分的气-质联用分析结果

酯类化合物是一种很重要的风味物质，主要由脂肪酸与醇类发生酯化反应生成，具有清新的水果、奶油香气，气味柔和、清爽。很多酯类的风味阈值非常低，虽然在检测结果中质量分数不高，但是对风味作用很大，尤其是中短碳链脂肪酸乙酯具有较大的风味贡献潜力[18]。由表6可知，发酵样品中的酯类物质有乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等。在3株酵母菌发酵样品中，均含有乙酸乙酯这类化合物，乙酸乙酯是一类无色透明液体，有果香，也是一种食用香精。MJ2乳源酵母菌产生的酯类物质只有乙酸乙酯（表6），感官风味表现单一。MJ1和NJ6发酵样品中均含有丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等多种中短碳链的脂肪酸乙酯。己酸乙酯和丙酸乙酯具有水果的清香味，是我国食品添加剂使用卫生标准允许使用的食用香料。因此，MJ1和NJ6呈现出比MJ2更丰富的风味层次。

醛类风味阈值较低。由于醛基的不饱和性，属于不稳定的中间体化合物[19]，其氧化快，在长时间的发酵过程中，易生成酸类物质，有助于奶啤香气的形成。由表6可知，发酵样品中的醛类物质苯甲醛等。苯甲醛具有苦杏仁、樱桃及坚果香，为国标GB2076-2011允许使用的食品用合成香料。醛类物质虽然含量较小，但对奶啤的香气贡献较大[9]。由表6得知，MJ1发酵样品中醛类相对质量分数约为1.54%，种类丰富，NJ6有两种醛类物质，相对质量分数约为0.59%，MJ2发酵样品中醛类物质有3种，相对质量分数约为1.64%。

酮类是大多数乳制品具有的典型物质，且具有较低的感知阈值[20]，能赋予发酵液奶油香气，使整体风味丰满。从表6可知，发酵样品中的酮类物质有2-庚酮等。2-庚酮具有草本植物的气味，由亚油酸氧化而来[21]，主要贡献了奶啤奶油香气。由表6可知，MJ1和NJ6发酵样品中均含有酮类物质。

酸类不仅是香气化合物也是其他醇、醛类和酯类化合物的前体。由于其低的香气阈值，中短链羧酸被认为是影响奶啤风味的重要因素。由表6可知，发酵样品中的酸类物质有己酸、辛酸等己酸和辛酸能为乳制品提供特征的香气。3株酵母菌发酵样品中，MJ2不含有酸类物质，可能会造成奶啤整体风味的失衡。

从表6挥发性成分的综合性分析中，奶啤中的风味物质主要由醇类、酯类、醛类、酸类和酮类等5大类物质构成。根据DebebeAlemayehu等人的研究结果[15]表明，决定乳品发酵风味的关键因素在于风味物质种类的平衡性。在3株酵母菌发酵产生的风味物质中，MJ1和NJ6酵母菌均能产生这5大类风味物质，MJ2发酵样品则同时缺乏酮类物质和酸类物质。因此，从风味物质种类的平衡性上分析，排除酵母菌MJ2，但无法对酵母菌MJ1和NJ6进行比较。因此，对于优质酵母菌的筛选需要进行对发酵产品理化和卫生指标、感官评定、风味物质的综合性评价。

2.2.3.3 乳源酵母菌MJ1、MJ2和NJ6代谢产物主成分分析及综合评价

将发酵样品的感官评定、挥发性风味成分的组成以及是否满足奶啤生产的要求（表3：理化指标和卫生指标），作为乳源酵母菌MJ1、MJ2和NJ6发酵特性的重要评价参数，对其进行主成分分析，结果如图1所示。

图1 3株酵母菌发酵奶啤的主成分分析

由图1可以看出，第一主成分(69.48%)和第二主成分(15.97%)的累积贡献率达到85.45%。通常，主成分贡献率累积超过85%时，可以用主成分代表原始数据[22]。所以这两个主成分能基本反映原变量的信息。因此，根据3株乳源酵母菌发酵特性和感官属性之间的相关性，空白对照和3种奶啤的载荷值被分成4组。

以第一主成分作为横坐标，第二主成分作为纵坐标做成散点图。由图1可知，第一组空白组位于第二象限，其特征是具有最高含量的酯类、酮类和pH值。第二组MJ2位于第三象限，其特征是具有最高含量的醛类和乙醇。第三组NJ6位于第四象限，其特征是具有高含量的酸类和醇类物质。最后一组是MJ1，位于第一象限，其特征具有最佳的色泽、味道、口感、风味、气泡含量和最高的总固形物、蛋白含量和总体评分。

4个发酵样品在PC1和PC2的主成分散点图分属4个象限，距离分开，表明特征差异显著，主成分分析法可以实现对样品特征差异性的评价，因此，基于奶啤的各种主要特征，选择乳源酵母MJ1作为奶啤生产菌株。

2.3 乳源酵母菌MJ1的分子生物学鉴定

将乳源酵母菌MJ1测序后的序列，在GenBank核酸序列数据库中进行序列搜索，比较分析（Blast）乳源酵母菌MJ1序列与已知酵母菌株序列的相似度。如图1所示MJ1酵母菌与近缘模式菌株的关系，如图2所示。

图2 5.8S ITS序列构建的系统树，供试乳源酵母菌株MJ1与近缘模式菌株的关系

由图2可以看出，筛选到的乳源MJ1酵母菌与同源性高达99%的Kluyveromyces marxianus KF646188.1和 Kluyveromycesmarxianus KP132324.1亲缘关系很近，根据Wu和Ahn的研究[23]，两菌株的序列一致性大于99%应归为同一物种，因此判断这一株酵母菌为马克思克鲁维酵母。

3 结论

由源自新疆乌鲁木齐地区的开菲尔粒中分离选育出了17株乳源酵母菌。对17株乳源酵母菌的发酵产品进行了理化和卫生的测定，结果表明其中5株酵母菌发酵产物符合奶啤生产标准。对这5株酵母菌进行遗传稳定性分析，发现3株酵母菌稳定性良好。最后通过对3株酵母菌的理化、感官和风味结果进行主成分分析，MJ1菌株发酵整体风味最佳，经鉴定为马克思克鲁维酵母。目前，正对MJ1菌株的抗菌性、酸耐受性等相关益生特性进行研究，期待MJ1菌株对优质奶啤产品生产与开发起到重要作用。

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Study on screening of high quality dairy yeast for milk beer producing and fer⁃mentation characteristics

HU Man1,WANG Liang1,GONG Xiaofen1,WANG Jiangyue1, LIU Penglong2,ZHAN Tao2,LI Yang2
(1.Jiangsu University,School of Food and Biological Engineering,Zhenjiang 212013,China; 2.Xinjiang Tianrun biotechnology co.LTD,Urumqi 830088，China)

Yeast species play an important role on the qualities of processed milk beer.The study seeks to screen and assess the fermentation performance of dairy yeast from Kefir grains products obtained from Urumchi,Xinjiang Province,China.The screening assessment criteria were based on colony morphology and evaluation of the product based on metabolism,genetic stability and sensory characteristics and vola⁃tile profile of the milk beer.In order to highlight the prominent features of each milk beer obtained from different yeasts,PCA was carried out using the quality index,sensorial attributes and the volatile profile.In all,17 strains were screen out of which Kluyveromyces marxianus (MJ1)was identified to be the most suitable based on the assessment criteria.The results show that MJ1 fermentation products met the physical and hygiene quality standards of industrial milk beer product,alcohol production was 3.88 g/L.MJ1 was stable genetically.Based on its main attributes employed in the PCA(Principal component analysis),MJ1 was found to be the best yeast to be used in the production of milk beer.

milk beer;yeast;screening;solid-phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry(SPME-GC-MS);principal component analysis(PCA);identification

TS252.54

：A

：1001-2230（2017）07-0027-06

2016-12-13

新疆生产建设兵团工业及高新技术科技攻关与成果转换计划项目（2015AB032）；江苏大学高级专业人才科研启动基金（12JDG069）。

胡曼（1990-），女，硕士，从事奶啤饮料的研究。

王亮