腺苷酸核糖基化因子1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与泌乳的影响

穆莹，郑冰，张宏伟，徐渐

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030；2.顺德出入境检验检疫局，广东佛山528000）

腺苷酸核糖基化因子1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与泌乳的影响

穆莹1，郑冰2，张宏伟1，徐渐1

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030；2.顺德出入境检验检疫局，广东佛山528000）

以奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究了腺苷酸核糖基化因子1（ARF1）对细胞泌乳及增殖的影响。对细胞分别进行ARF1过表达与抑制、mTOR抑制及mTOR抑制后ARF1过表达处理，用MTT法检测细胞增殖，试剂盒检测乳糖和乳脂分泌，蛋白质免疫印迹检测β-酪蛋白（CSN2）及ARF1，mTOR，p-mTOR，Cyclin D1，SREBP1的表达。结果表明：ARF1过表达或抑制后，细胞增殖与泌乳及p-mTOR，Cyclin D1，SREBP1的表达均显著增加或降低；mTOR表达变化不显著。mTOR抑制后，细胞增殖与泌乳及p-mTOR、Cyclin D1、SREBP1的表达均显著降低，ARF1表达变化不显著；并且，在mTOR被抑制的细胞中，过表达ARF1，不能使细胞的细胞增殖与泌乳及p-mTOR，Cyclin D1，SREBP1的表达恢复。实验说明，ARF1是奶牛乳腺上皮细胞中细胞增殖和泌乳的正向调控因子，它通过mTORC1通路调控细胞增殖和泌乳。

腺苷酸核糖基化因子1；奶牛乳腺上皮细胞；细胞增殖；泌乳；mTORC1通路

0 引言

奶牛乳腺细胞的增殖及泌乳受激素、营养素和能量等多种因素的调控[1-3]。在奶牛乳腺上皮细胞中，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（mTORC1）信号通路对细胞增殖及泌乳有重要调控作用，mTORC1能够广泛接收各种信号，调控细胞的增殖及泌乳[4-6]。研究表明，细胞中mTORC1通路的激活、细胞增殖及泌乳的调控是一个复杂的网络调控过程[7-10]。并且，就目前而言，细胞中有哪些因子参与这一调控过程？它们的调控通路及机制是什么？这些都还知之甚少。本研究以泌乳奶牛乳腺上皮细胞为材料，研究腺苷酸核糖基化因子1（ARF1）对细胞中mTORC1通路的激活及细胞增殖与泌乳的调控作用。本研究完善了mTORC1调控乳腺细胞增殖及泌乳的调控通路，加深了人们对乳腺细胞增殖及泌乳的调控机制的认识。

1 实验

1.1 材料

奶牛乳腺上皮细胞由本实验室纯化保存。DMEM/F12培养基，胎牛血清（FBS），Trizol试剂，脂质体2000，DMSO，双抗，Flag标签表达载体，MTT，反转录试剂，PCR试剂，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，si-RNA干扰片段，乳糖检测试剂盒，甘油三酯检测试剂盒，SREBP1抗体，CyclinD1抗体，ARF1抗体，mTOR抗体，p-mTOR抗体，β-actin抗体，β-casein抗体，HRP标记的二抗。

1.2 奶牛乳腺上皮细胞的培养

奶牛乳腺上皮细胞用DMEM/F12培养基（添加10%FBS和100 U/mL的双抗），37℃，CO2培养箱中培养[10]。进行实验的细胞以5.0×104个/mL培养液的密度接种于6孔板，待细胞长至约80%汇合度时按实验需求进行处理，收样备用。

1.3 表达载体构建与si-RNA片段的合成

Trizol法提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA，反转录成cDNA作为模板，根据NCBI基因库中奶牛ARF1的基因序列（NM_176653.4）设计特异性引物，进行PCR扩增ARF1基因，扩增的目的条带回收、酶切、克隆进真核表达载体pCMV-C-Flag、测序。测序正确的阳性克隆扩大培养、提取质粒备用（ARF1过表达载体标记为AO）。PCR扩增引物及酶切位点如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGGGGAATATC TTTGCA-3’下划线为EcoR I酶切位点；

下游引物：5’-GCGTCGACTTTCTGGTTCCG⁃GAGCTG-3’下划线为Sal I酶切位点。

ARF1及mTOR的si-RNA特异性干扰片段、阴性对照片段均由苏州吉玛基因股份有限公司合成。

1.4 细胞转染

细胞在6孔板中培养至80%汇合度，换成无血清无双抗的培养基培养，空载体（EV）、ARF1过表达载体（AO）、阴性对照片段（NC）、ARF1干扰片段（si-A）及mTOR干扰片段（si-M）均按实验需求用脂质体2000进行转染，实验操作参照说明书。转染培养6 h后，更换能有血清有双抗的正常培养基常规培养24 h，收样待检。

ARF1过表达实验分组为：空白对照组（B）、转空质粒组（EV）和ARF1过表达组（AO）；ARF1抑制实验分组为：空白对照组（B）、转阴性片段组（NC）和ARF1抑制组（si-A）；ARF1和mTOR双处理实验分组为：空白对照组（B）、转阴性片段组（NC）、mTOR抑制组（si-M）和mTOR抑制/ARF1过表达组（si-M/ AO）组。

1.5 细胞增殖检测（MTT法）

细胞以5.0×103个/孔的密度接种于96孔板中，正常培养12 h，根据实验需要进行转染处理20 h，然后在培养液中添加MTT至终质量浓度为0.5 g/L（MTT母液用PBS稀释），继续培养4 h。弃培养液，加150 μL/孔的DMSO，室温震荡孵育10 min，用酶标仪检测样品在450 nm的吸光度值[11]。

1.6 细胞活力分析

细胞处理24 h后，细胞样品用CASY-ton缓冲液1∶100稀释，然后用CASY细胞分析仪检测细胞活力。

1.7 乳糖与乳脂检测

细胞处理24 h后收集细胞培养液，用乳糖和甘油三酯检测试剂盒检测培养液中的乳糖和甘油三酯。

1.8 蛋白质免疫印迹（WB）分析

细胞用6孔板正常培养，至所需汇合度（70%～80%），然后按实验需要进行添加氨基酸或基因过表达与抑制处理。各组细胞处理24 h后，常规方法进行蛋白质免疫印迹（WB）分析。WB实验中，兔多克隆β-casein一抗使用浓度为1∶1000；兔多克隆mTOR一抗、p-mTOR一抗、GLUT1一抗、SREBP-1c一抗、p-SREBP-1c一抗、GPR87一抗、鼠多克隆β-actin使用浓度均为1∶500；所有HRP标记的二抗使用浓度为1∶2000。

1.9 数据统计与分析

实验数据用Microsoft Excel进行统计分析，用单因素方差分析分析组间差异，结果用“平均值±标准差”表示。WB灰度值用ImageJ2x软件分析。

2 结果与分析

2.1 ARF1对细胞增殖的影响

对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行ARF1的过表达和抑制，用MTT法检测细胞增殖，CASY细胞活力分析仪检测细胞活力。ARF1过表达实验分为空白对照组（B）、转空质粒组（EV）和ARF1过表达组（AO）；ARF1抑制实验分为空白对照组（B）、转阴性片段组（NC）和ARF1抑制组（si-A）。结果如图1所示，在ARF1过表达实验中，与B组和EV组比较，AO组细胞增殖与细胞活力显著增加（p＜0.05）（图1（a）（c））；在ARF1抑制实验中，与B组和NC组比较，si-A组细胞增殖与细胞活力显著降低（p＜0.05）（图1（b）（d））。结果说明，ARF1能正向调控奶牛乳腺上皮细胞的细胞增殖和细胞活力。

图1 ARF1过表达与抑制对细胞增殖及细胞活力的影响

图1中，（a）和（b）为MTT法检测ARF1过表达（a）和抑制（b）对细胞增殖的影响。空白组（B组）细胞增殖率定义为“1”；（c）和（d）为CASY细胞活力分析仪检测ARF1过表达（c）和抑制（d）对细胞活力的影响。B表示空白对照组，EV表示转空质粒组，AO表示ARF1过表达组，NC表示阴性对照组，si-A表示ARF1抑制组。“∗∗”表示与空白组比较差异显著（p＜0.05）。

2.2 ARF1对细胞泌乳的影响

对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行ARF1的过表达和抑制，收样。用试剂盒检测细胞培养液中乳糖和乳脂的浓度，蛋白质免疫印迹检测细胞中乳蛋白的合成。实验分组同细胞增殖与活力检测实验，结果如图2所示。由图2可以看出，在ARF1过表达实验中，与B组和EV组比较，AO组细胞分泌乳糖、乳脂及合成CSN2的能力显著增加（p＜0.05）（图2（a）（b）（c）（d））；在ARF1抑制实验中，与B组和NC组比较，si-A组细胞分泌乳糖、乳脂及合成CSN2的能力显著降低（p＜0.05）（图2（e）（f）（g）（h））。结果说明，ARF1能正向调控奶牛乳腺上皮细胞的乳糖、乳脂分泌及乳蛋白合成。

图2 ARF1过表达与抑制对细胞泌乳能力的影响

图2中，（a）和（b）为试剂盒检测ARF1过表达对细胞分泌乳糖（a）和乳脂（b）的影响；（c）和（d）为蛋白质免疫印迹检测ARF1过表达对细胞中CSN2表达的影响；（e）和（f）为试剂盒检测ARF1抑制对细胞分泌乳糖（e）和乳脂（f）的影响；（g）和（h）为蛋白质免疫印迹检测ARF1抑制对细胞中CSN2表达的影响，空白组（B组）蛋白灰度值定义为“1”。B表示空白对照组，EV表示转空质粒组，AO表示ARF1过表达组，NC表示阴性对照组，si-A表示ARF1抑制组。“∗∗”表示与空白组比较差异显著（p＜0.05）。

2.3 ARF1对mTOR、p-mTOR、CyclinD1和SREBP1表达的影响

对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行ARF1的过表达和抑制，收样。用蛋白质免疫印迹检测细胞中mTOR、p-mTOR、Cyclin D1和SREBP1的表达。实验分组同细胞增殖与活力检测实验。结果如图3所示，在ARF1过表达实验中，与B组和EV组比较，AO组细胞中p-mTOR、Cyclin D1和SREBP1的表达显著增加（p＜0.05），但mTOR的表达无显著变化（p＞0.05）（图3（a）（b））；在ARF1抑制实验中，与B组和NC组比较，si-A组细胞中p-mTOR、Cyclin D1和SREBP1的表达显著降低（p＜0.05），但mTOR的表达无显著变化（p＞0.05）（图3（c）（d））。结果说明，ARF1能促进奶牛乳腺上皮细胞中的mTOR磷酸化，激活mTOR通路，上调Cyclin D1和SREBP1的表达。

图3 ARF1过表达与抑制对mTOR，p-mTOR，Cyclin D1和SREBP1表达的影响

图3中，（a）和（b）为蛋白质免疫印迹检测ARF1过表达对细胞中mTOR，p-mTOR，Cyclin D1和SREBP1表达的影响；（c）和（d）为蛋白质免疫印迹检测ARF1抑制对细胞中mTOR，p-mTOR，Cyclin D1和SREBP1表达的影响，空白组（B组）蛋白灰度值定义为“1”。B表示空白对照组，EV表示转空质粒组，AO表示ARF1过表达组，NC表示阴性对照组，si-A表示ARF1抑制组。“∗∗”表示与空白组比较差异显著（p＜0.05）。

2.4 ARF1通过mTORC1通路调控细胞增殖与泌乳

对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行mTOR抑制、mTOR抑制后过表达ARF1处理，收样。用MTT法检测细胞增殖，CASY细胞活力分析仪检测细胞活力，试剂盒检测细胞培养液中乳糖和乳脂的浓度，蛋白质免疫印迹检测细胞中ARF1、CSN2、Cyclin D1和SREBP1的表达。实验分为空白对照组（B）、阴性对照组（NC）、mTOR抑制组（si-M）和mTOR抑制/ ARF1过表达组（si-M/AO）组。结果如图4所示，在细胞增殖方面，与B组和NC组比较，si-M组细胞增殖与细胞活力显著下降（p＜0.05），并且mTOR抑制后，过表达ARF1并不能使细胞增殖与细胞活力恢复（图4（a）（b））；在泌乳能力方面，与B组和NC组比较，si-M组细胞分泌乳糖、乳脂及合成CSN2的能力显著下降（p＜0.05），并且mTOR抑制后，过表达ARF1并不能使细胞分泌乳糖、乳脂及合成CSN2的能力恢复（图4（c）（d）（e）（f））。此外，与B组和NC组比较，si-M组细胞中Cyclin D1和SREBP1的表达显著下降（p＜0.05），并且mTOR抑制后，过表达ARF1并不能使细胞中Cyclin D1和SREBP1的表达恢复（图4（e）（f））；但是，与B组和NC组比较，si-M组细胞中ARF1的表达无显著变化（p＞0.05）。结果说明，ARF1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与泌乳及Cy⁃clin D1、SREBP1表达的调控是通过mTORC1通路实现的。

图4中，（a）为MTT法检测mTOR抑制及mTOR抑制/ARF1过表达对细胞增殖的影响;（b）为CASY细胞活力分析仪检测mTOR抑制及mTOR抑制/ARF1过表达对细胞活力的影响；（c）和（d）为试剂盒检测mTOR抑制及mTOR抑制/ARF1过表达对细胞分泌乳糖（c）和乳脂（d）的影响；（e）和（f）为蛋白质免疫印迹检测mTOR抑制及mTOR抑制/ARF1过表达对细胞中CSN2、Cyclin D1及SREBP1表达的影响，空白组（B组）蛋白灰度值定义为“1”。B表示空白对照组，NC表示阴性对照组，si-M表示mTOR抑制组，si-M/AO表示mTOR抑制/ARF1过表达组。“∗∗”表示与空白组比较差异显著（p＜0.05）。

3 讨论

3.1 ARF1对奶牛乳腺上皮细胞增殖的调控

图4 通过mTOR通路调控细胞增殖与泌乳

腺苷酸核糖基化因子（ARF）广泛存在于真核生物中，是在动植物演化发展中高度保守的GTP激酶，属于小G蛋白Ras家族[11-13]。ARF1是ARF家族中重要的一员，它广泛定位于高尔基体上，与高尔基复合体相关[14-15]。目前研究表明，ARF1在囊泡运输、磷脂代谢、细胞内物质运输与信号转导过程中具有重要生物学功能[16-18]。此外，近年来研究表明，ARF1还与多种肿瘤的发生密切相关，它对癌细胞的细胞增殖、PI3K信号通路及对MAPK信号通路均有调控作用[19-20]。在本实验中，对奶牛乳腺细胞中进行了ARF1的过表达和抑制，结果显示，ARF1过表达后，细胞生长率和细胞活力均显著提高；ARF1抑制后，细胞生长率和细胞活力均显著降低，这说明ARF1能够促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖。

本实验还对ARF1促进乳腺上皮细胞增殖的分子机制做了初步的探究。实验对ARF1过表达或抑制后的细胞中的mTOR、p-mTOR和Cyclin D1等与细胞增殖有关的信号分子进行了检测。结果表明，ARF1的过表达和抑制能使细胞中的p-mTOR与Cyclin D1的表达均上升，但mTOR的表达没变化，这说明ARF1可能是通过促使细胞中mTOR的磷酸化，激活mTORC1信号通路及促进Cyclin D1的表达来正向调控细胞增殖的。此外，实验还进一步对细胞进行了抑制mTOR，然后过表达ARF1的双重处理，结果显示，mTOR抑制后，细胞的生长及活力显著降低，细胞中p-mTOR及Cyclin D1的表达也显著下降，但ARF1的表达无明显变化。并且，在抑制了mTOR的细胞中过表达ARF1并不能使细胞生长及活力得到恢复，也不能使细胞中p-mTOR及Cyclin D1的表达回升。这个结果进一步说明了在奶牛乳腺上皮细胞中，ARF1是通过激活细胞中的mTORC1通路来调控细胞增殖的。

3.2 ARF1调控奶牛乳腺上皮细胞泌乳的调控

奶牛乳腺细胞泌乳的调控是一个复杂的网络调控过程，它涉及到多个信号分子及信号通路。有研究表明，在奶牛乳腺上皮细胞中，SREBP1是细胞合成与分泌乳脂的关键调控因子[21]；还研究表明，细胞中的mTOR及其参与的mTORC1通路对乳腺细胞的泌乳有重要调控作用，并且细胞中很多蛋白酶及具有GTP酶活性的小G蛋白都能激活细胞中的mTORC1通路[22]。有研究表明，ARF1对细胞中mTORC1信号通路及SREBP1有调控作用[23-24]。在本实验中，对奶牛乳腺细胞中进行了ARF1的过表达和抑制，结果显示，ARF1过表达和抑制后，细胞分泌乳糖和乳脂及合成酪蛋白的能力显著提高和降低，这说明ARF1能够促进奶牛乳腺上皮细胞中乳糖、乳脂的分泌和乳蛋白的合成，上调细胞的泌乳能力。

此外，本研究还进一步检测了ARF1对细胞中泌乳相关的信号因子的表达的影响。结果显示，ARF1过表达或抑制后，细胞中的p-mTOR与SREBP1的表达均上升，但mTOR的表达没变化，这说明ARF1可能是通过促使细胞中mTOR的磷酸化，激活mTORC1信号通路及促进SREBP1的表达来正向调控细胞泌乳的。实验还进一步对细胞进行了抑制mTOR，然后过表达ARF1的双重处理，结果显示，mTOR抑制后，细胞的泌乳能力显著降低，细胞中p-mTOR及SREBP1的表达也显著下降，但ARF1的表达无明显变化。并且，在抑制了mTOR的细胞中过表达ARF1并不能使细胞的泌乳能力得到恢复，也不能使p-mTOR及SREBP1的表达回升。这个结果进一步说明了在奶牛乳腺上皮细胞中，ARF1是通过激活细胞中的mTORC1通路来调控细胞泌乳的。

4 结论

本研究表明，ARF1是奶牛乳腺上皮细胞中细胞增殖和泌乳的正向调控因子，它通过调节mTORC1通路，促进mTOR的磷酸化、Cyclin D1和SREBP1的表达调控细胞增殖和泌乳。

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Effects of ADP ribosylation factor 1 on proliferation and lactation in dairy cow mammary epithelial cells

MU Ying1，ZHENG Bing2，ZHANG Hongwei1，XU Jian1
（1.Food Science College of northeast agricultural university，Harbin 150030，China；2.Entry-exit Inspection and Quar⁃antine Bureau of Shunde，Foshan 528000，China）

The role of ADP ribosylation factor 1（ARF1）in cell proliferation and lactation of bovine mammary epithelial cells（BMECs）was investigated.The BMECs were treated with ARF1 overexpression，ARF1 silencing，mTOR silencing，and mTOR silencing/ARF1 overex⁃pression，respectively.The cell proliferation was detected by MTT；the secretion of lactose and milk fat was detected by lactose assay kit and triglyceride detection kit，respectively；the expression ofβ-casein（CSN2），ARF1，mTOR，p-mTOR，Cyclin D1，and SREBP1 was detect⁃ed by western blotting.The result showed that the BMECs treated with ARF1 overexpression and silencing，the cell proliferation，lactation，and the expression of p-mTOR，Cyclin D1，and SREBP1 were significant increased and significant decreased，respectively，but the expres⁃sion of mTOR was no significant changed.The BMECs treated with mTOR silencing，the cell proliferation，lactation，and the expression of p-mTOR，Cyclin D1，and SREBP1 were significant decreased，but the expression of ARF1 was no significant changed.What’s more，after mTOR silencing，the cell proliferation，lactation，and the expression of p-mTOR，Cyclin D1，and SREBP1 were not restored in the BMECs treated with ARF1 overexpression.These results suggested that ARF1 can positively regulate cell proliferation and lactation via mTORC1 pathway.

ADP ribosylation factor 1；bovine mammary epithelial cells；cell proliferation；lactation；mTORC1 pathway

TS252.1

：A

：1001-2230（2017）07-0018-05

2017-01-16

穆莹（1982-），女，硕士，研究方向为乳品加工技术。