HPLC测定瑞格列奈片的含量

何小琳，张颖，董爽，王迷娟

（1.北京协和药厂，北京 102600；2.北京协和制药二厂，北京 102600）

HPLC测定瑞格列奈片的含量

何小琳1，张颖1，董爽2，王迷娟1

（1.北京协和药厂，北京 102600；2.北京协和制药二厂，北京 102600）

目的：建立瑞格列奈片的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法对瑞格列奈成分进行含量测定。色谱柱：DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：醋酸铵缓冲液（取醋酸铵3.85 g，加水1000 mL溶解后，用冰醋酸调pH值至4.0）-甲醇（20∶80）为流动相；流速：1.0 mL/min；检测波长为243 nm；柱温为25℃；进样量为20 μL。结果：瑞格列奈在10～30 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数r为0.999 6；平均回收率为100.4%，RSD为1.22%；24 h内瑞格列奈溶液稳定性良好，RSD为1.08%。结论：本方法操作简便，结果准确、可靠，可用于瑞格列奈片的含量测定。

高效液相色谱法；瑞格列奈片；含量

瑞格列奈片系德国Boehringer Ingelhei公司研制，由丹麦Novo Nordisk公司开发并于1998年在美国首次上市，商品名为Prandin。2000年在中国上市，商品名为诺合龙[1-2]，主要成份化学名称为：S（＋）-2-乙氧基-4[2-[[3-甲基-1-[2-（1-哌啶基）苯基]-丁基]氨基-2-氧乙基]苯甲酸，分子式为C27H36N2O4，是非磺酰脲类结构的胰岛素分泌促进剂[3-4]，为新型短效口服促胰岛素分泌降糖药，通过与不同受体结合关闭β细胞膜中ATP-依赖性钾通道而发挥降糖作用[5]，用于饮食控制及运动锻炼不能有效控制高血糖的2型糖尿病（非胰岛素依赖型）患者，具有良好的降血糖效果。可单用或与其他降糖药合用，如二甲双胍[6]等，具有广泛的应用范围。本文主要研究瑞格列奈片的含量测定方法。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪及其工作站（DAD检测器）；Xs 205电子分析天平（瑞士Mettler公司，精密度为十万分之一）；色谱柱：DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；瑞格列奈对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100753-200501）；瑞格列奈片为自制片，批号：101103（规格：1.0 mg）；瑞格列奈空白片为自制片，批号：101100。甲醇为色谱纯，实验用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：醋酸铵缓冲液（取醋酸铵3.85 g，加水1000 mL溶解后，用冰醋酸调pH值至4.0）-甲醇（20∶80）为流动相；流速：1.0 mL/min；检测波长：243 nm；柱温：25℃；进样量：20 μL。

2.2 供试品溶液制备

取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于瑞格列奈1.0 mg），置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液适量，振摇使瑞格列奈溶解，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 对照品溶液制备

取瑞格列奈对照品适量，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含20 μg的溶液。

2.4 系统适用性试验

取瑞格列奈适量，用磷酸二氢钾缓冲溶液（取磷酸二氢钾4.0 g，加水约900 mL溶解后，用磷酸调节pH值至3.2，再加水至1 000 mL）-乙腈（20:80）溶液溶解并制成每1 mL约含1 mg的溶液，置水浴90℃中加热至溶剂剩余约20%，将样品加塞密闭置于90℃烘箱继续加热24 h，冷却至室温，用磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈（20∶80）溶解并稀释，得系统适用性溶液。取系统适用性溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，降解产物与瑞格列奈依次出峰，其分离度应符合要求。瑞格列奈保留时间为13.5 min，降解产物与瑞格列奈峰分离度为4.3，符合规定。色谱图见图1。

图1 瑞格列奈及瑞格列奈系统适用性HPLC图

2.5 线性关系考察

取瑞格列奈对照品适量，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶解并定量稀释成每1 mL中约含0.1 mg的贮备液。精密吸取贮备液1.0，1.5，2.0，2.5 mL和3.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，得浓度分别约为10，15，20，25，30 μg/mL的系列标准溶液。取上述系列标准溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，进样20 μL，记录色谱图。以进样浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标作图，线性回归，得标准曲线方程

y＝30.473x－8.850 4（r＝0.9996，n＝5）。

结果表明，瑞格列奈浓度在10～30 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.6 仪器精密度实验

按“2.2”项下供试品溶液制备方法，取供试品溶液1份，按照“2.1”色谱条件测定，连续进样6次，记录色谱图，考察主峰峰面积变化情况，考察仪器精密度。可接受标准：RSD≤2.0%。结果，瑞格列奈峰面积RSD＝0.2%。表明方法仪器精密度良好。

2.7 重复性实验

按“2.2”项下供试品溶液制备方法，配制6份相同浓度的供试品溶液，按照“2.1”色谱条件测定，记录色谱图。同时用对照品溶液进行当中测定，计算6份供试品溶液的含量的相对标准偏差，考察方法的重复性。可接受标准：RSD≤2.0%。结果，含量平均值为101.6%，RSD＝0.55%。

2.8 中间精密度实验

对同一批次的瑞格列奈片（批号：101103），在不同时间、不同仪器上，由不同实验员操作，各平行配制6份，测定含量，对数据检测结果进行统计分析，计算所得12个含量数据的相对标准偏差，验证其中间精密度。可接受标准：RSD≤2.0%。按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定。结果，含量平均值为100.1%，RSD＝1.81%。表明方法中间精密度良好。

2.9 稳定性实验

按“2.2”项下方法制备供试品溶液，室温放置0，2，4，6，8，10，12，24 h按照“2.1”色谱条件测定，记录瑞格列奈峰面积。结果，瑞格列奈峰面积RSD＝1.08%。表明，瑞格列奈含量测定供试品溶液在24 h内稳定。

2.10 回收率实验

精密称取等量空白辅料，精密加入一定量的瑞格列奈对照品，按“2.2”项下供试品溶液制备方法操作，使最终的样品中对照品浓度为80%，100%，120%，每个浓度平行操作3份。混合均匀，按“2.1”色谱条件测定，考察检测方法的准确度。范围：工作浓度的80%～120%。可接受标准：RSD≤2.0%。回收率结果见表1。

表1 回收率实验结果（n＝9）

2.11 耐用性实验

实验考察了不同柱温、不同流速、不同流动相比例、流动相A的不同pH值条件，计算瑞格列奈的含量，验证该方法的耐用性。可接受标准：RSD≤2.0%。结果表明柱温在±5℃范围变化、流速在±0.2 mL/min范围变化、流动相比例在±5%范围变化、流动相A的pH值在±0.2范围变化，瑞格列奈含量稳定，RSD均符合规定。该含量测定方法的耐用性良好。

2.12 样品的含量测定

取“2.2”项下的供试品溶液及“2.3”项下的对照品溶液各20 uL，按“2.1”色谱条件测定。按外标法以峰面积分别计算样品中的瑞格列奈的含量，平行3份，结果为99.8%，RSD为1.08%。

3 讨论

3.1 系统适用性溶液的制备

经实验，瑞格列奈项下有关物质项中，供试品溶液经90℃水浴中放置24 h并放冷，相对于瑞格列奈峰保留时间约为1.1处的杂质峰未有检出。考察发现，将有关物质项下供试品溶液置水浴90℃中加热至溶剂剩余约20%，将样品加塞密闭置于90℃烘箱继续加热24 h，冷却至室温，用磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈（20:80）溶解并稀释，相对于瑞格列奈峰保留时间约为1.1处的杂质峰能够检出，符合规定。将按此条件制备的系统适用性溶液用于瑞格列奈片含量测定中，杂质峰检出明显，更有利于考察色谱条件的分离效果，确保含量测定结果的准确性。

3.2 检测波长的选择

采用Agilent工作站的DAD检测器全波长对瑞格列奈溶液进行检测，瑞格列奈在210，243，296 nm波长处有最大吸收，参考辅料峰的大小，选择243 nm作为检测波长。

3.3 专属性考察

按“2.2”项下方法，配置瑞格列奈供试品溶液；同法配制不含主药的空白辅料溶液。按“2.3”项下方法配置瑞格列奈对照品溶液。分别取空白辅料溶液、供试品溶液和对照品溶液，按“2.1色谱条件”测定。结果，瑞格列奈对照品溶液的色谱图中主峰的保留时间与供试品溶液中瑞格列奈主峰的保留时间一致；空白辅料溶液色谱图中在瑞格列奈色谱峰处未见任何相同保留时间的色谱峰。空白辅料溶液对瑞格列奈测定无干扰，方法具有专属性。

3.4 色谱柱的选择

实验比较了不同厂家不同品牌的色谱柱，按“2.4”项下系统适用性实验进行降解物与瑞格列奈分离度考察。结果，迪马色谱柱分离效果强，各降解峰均能检出，降解物与瑞格列奈分离度符合规定。为保证方法的准确、可靠，本实验规定采用DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行含量分析。

[1] 刘萍.糖尿病治疗药-瑞格列奈[J].国外医药-合成药、生化药、制剂分册, 1999,20(4):220-221.

[2] 韩莹,屠树滋,王秋娟.治疗糖尿病药物的研究进展[J].中国新药杂志,2000,9(7):442-448.

[3] 潘晓燕,吴文俊,沈飞霞.瑞格列奈治疗中重度初诊2型糖尿病的疗效和安全性[J].中国临床药学杂志,2011,20(1): 24-27.

[4] 刘建朝,嵇汝运.促胰岛素分泌杭糖尿病药物研究进展[J].中国药学杂志,2005,40(6):408-410.

[5] 王淑梅,杨莲英,赵合兴.口服降糖药的临床应用[J].华西药学杂志,2004,19(2):158-160．

[6] 金绍礼.瑞格列奈联合二甲双胍治疗初发Ⅱ型肥胖型糖尿病的疗效观察[J].中国药房,2011,22(20):1876-1877.

本文编辑：鲁守琴

Content Determination of Repaglinide Tablets by HPLC

He Xiao-lin1, Zhang Ying1, Dong Shuang2, Wang Mi-juan1
(1. Beijing Union Pharmaceutical Factory, Beijing 102600, China, 2. The Second Union Pharmaceutical Factory of Beijing City, Beijing 102600, China)

Objective：To develop a method for determination of content of repaglinide tablets. Methods：HPLC was used for determination of contents of various components of repaglinide tablets. DIKMA Diamonsil C18(2) column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was adopted serving ammonium acetate buffer (3.85 g ammonium acetate solution dissolved in 1 000 mL of water, of which the pH value was adjusted to 4.0 with acetic acid)-methanol (20∶80) as mobile phase at a fow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 243 nm, while the column temperature was 25℃, and the sample loading was 20 μL. Results：The linear range of repaglinide was 10～30 μg/mL, with a r value of 0.999 6. The average recovery was 100.4%, with a RSD of 1.22%. The repaglinide solution showed good stability within 24 h, with a RSD of 1.08%. Conclusion：This method is simple, accurate and reliable, which is applicable for the quality control of repaglinide tablets.

HPLC; Repaglinide Tablets; Content

R927.2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.019

2017 - 03 - 22

何小琳，化学制药工程师。研究方向：药物分析。通讯作者E-mail：hxlcpu2010@126.com