反相高效液相色谱法同时测定丹参中5种成分含量

侯超

（郑州市中医院制剂室，河南 郑州 450000）

◆医药快讯◆

反相高效液相色谱法同时测定丹参中5种成分含量

侯超

（郑州市中医院制剂室，河南 郑州 450000）

目的：建立反相高效液相色谱法同时测定丹参中5种成分含量。方法：采用反相高效液相色谱法，色谱柱Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）为流动相梯度洗脱，测定丹参中5种成分的含量。结果：隐丹参酮、丹参酮IIA、丹酚酸、丹参素、迷迭香酸分别在0.420 0～16.800 0 µg，0.414 0～16.560 0 µg，0.656 0～26.240 0 µg，0.059 5～2.380 0 µg，0.346 0～13.840 0 µg范围内线性良好，r＝0.999 9，RSD均＜1.2%（n＝6），加样平均回收率98.68%～99.15%。结论：反相高效液相色谱法准确、快速、重复性好，同时可用于测定丹参中脂溶性和水溶性成分，可较全面控制丹参质量。

反相高效液相色谱法；丹参；含量测定

丹参属双子叶唇形科植物丹参的干燥根及根茎。近年来，广泛应用于临床心血管疾病治疗，具有降血压、抗血栓、降血脂、增加冠状动脉血流量、改善血液循环的作用，中医认为其有活血通经、清心除烦、祛瘀止痛的功效。丹参中主要功能成分为丹参素[1-2]。丹参中主要含有水溶性和脂溶性两大类成分，脂溶性成分主要由丹参酮类成分如隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等组成；水溶性成分主要由丹参酚酸类的丹参素、迷迭香酸、紫草酸、原儿茶醛、丹酚酸B等组成[3-4]。由于丹参中脂溶性成分和水溶性成分众多，丹参的产地多元化，叶子大小、生长年限、根茎粗细、栽培方式不同，丹参的质量参差不齐[5]。单一的指标成分不能完全衡量丹参的药材质量，本研究选取丹参素、丹酚酸B、迷迭香酸3种水溶性成分，隐丹参酮、丹参酮ⅡA 2种脂溶性成分，梯度洗脱，建立5种成分含量测定方法，全面、客观地控制药材质量。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国Waters E2695高效液相色谱仪（包括样品处理器、四元泵处理器、PDA检测器、柱温箱、Empower色谱工作站）；超声波清洗机SB25-12DT（宁波新芝生物科技股份有限公司）；色谱柱Welchrom C18（250 mm× 4.6 mm，5 µm，月旭科技股份有限公司）；Sartorius BT25S型电子天平（德国赛多利斯公司，感量：0.01 mg）。

1.2 试剂、试药

乙腈为色谱纯（德国Merck公司）；水为Millipore超纯水；其他试剂均为分析纯。丹酚酸B（批号：111562-201212）、隐丹参酮（批号：110852-200806）、丹参酮IIA（批号：110852-200806）、丹参素钠（批号：110855-201311）、迷迭香酸（批号：111871-201203）均购自南京春秋生物工程有限公司，纯度均＞98%，丹参饮片及药材均购于各地药材市场，所有样品经我院药剂科药师鉴定，均为唇形科植物丹参的干燥根及根茎。

2 方法

2.1 样品溶液的制备

取0.5 g丹参药材粉末，精密称定，加75%甲醇50 mL，摇匀，超声处理30 min，提取再称定质量，用75%甲醇补足质量，摇匀，经孔径0.45 µm滤膜取续滤液，置于4℃冰箱避光保存。

2.2 混合对照品容液

精密称定适量对照品（丹参素钠、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA），加75%甲醇制成混合对照储备溶液备用，浓度分别为59.5，656.0，346.0，221.0，414.0 µg/mL。

2.3 色谱

色谱柱Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；检测波长280 nm；柱温30℃；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），流速1.0 mL/min，进样量10 µL，梯度洗脱表，见表1。

表1 梯度洗脱表

2.4 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液，连续进样6次，测定其峰面积值。丹参素钠为1.23%，迷迭香酸为0.84%，丹酚酸B为0.96%，隐丹参酮为0.83%，丹参酮ⅡA为0.64%，仪器精密度良好。

2.5 线性范围考察

按“2.3”项色谱条件，取混合对照品溶液1，2，5，10，15，20，40 µL，分别进样，横坐标为X：对照品进样量，纵坐标Y：峰面积积分值，得到各成分的线性回归方程和线性范围，见表2。

表2 各成分线性回归方程和线性范围

2.6 稳定性试验

于制备后的0，3，6，12，24，48 h，精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，分析计算各组RSD，结果分别为0.48%，0.71%，0.52%，0.73%，0.55%，表明在48 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批号样品6份，制备供试品溶液，并按色谱条件进行测定，计算丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、迷迭香酸、丹参素钠含量的RSD，分别为0.71%，0.45%，0.72%，1.40%，1.55%，表示测定方法重复性良好。

2.8 加样回收率

取已知含量的丹参粉末，精密加入丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、迷迭香酸、丹参素钠对照品适量，按样品溶液制备法平行制备6份，进行色谱分析，回收率均在98.68%～99.15%，符合要求。结果见表3.。

表3 加样回收率测定结果

2.9 测定样品

按样品溶液制备法制备4批不同产地供试品溶液，测定色谱，记录色谱峰面积，外标法测定丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、迷迭香酸、丹参素钠含量[6]，结果见表4。

表4 样品检测结果 （mg/mL）

3 讨论

因本研究中同时测定丹参中的脂溶性和水溶性两种成分，目标分离成分极性相差较大，所以采用梯度洗脱。结果表明乙腈（A）-0.1%磷酸（B）系统洗脱能力强，保留时间比较短，可以使各指标良好分离。

参照《中华人民共和国药典》2010版，对丹参及其提取物质量控制指标成分进行选择，选定丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、迷迭香酸、丹参素钠指标成分，客观、全面地控制丹参的药材质量[7]。

综上所述，本研究建立的反相高效液相色谱法同时测定丹参中5种成分含量，可以较全面控制和反映丹参的药材质量。

[1] 吴学骋,舒阳,杨睿,等.反相高效液相色谱法测定不同产地丹参中丹参素的含量[J].湖北中医杂志,2014,36(9):68.

[2] 张珺,程月发,张爱兵.丹参胶囊水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱分析[J].医药导报,2015,34(1):89-94.

[3] 程沛,韩东岐,胡伟慧,等.高效液相色谱法同时测定丹参中10种水溶性和4种脂溶性成分的含量[J].药物分析杂志,2015,35(6):991-996.

[4] 程巧鸳,郭增喜,陈碧莲.RP-HPLC法同时测定香丹注射液中5-羟甲基糠醛和酚酸类成分的含量[J].医药导报,2015,34(1):95-98.

[5] 刁璇,肖丽和,林亚珠,等.多波长UPLC法同时测定冠心丹参胶囊中三七皂苷R1等5种有效成分的含量[J].沈阳药科大学学报,2015,32(6):445-450.

[6] Luo QL,Nurahmat M,Li MH,et al.Pharmacological investigation of a HPLC/MS standardized three herbal extracts containing formulae (Bu-Shen-Yi-Qi-Tang) on airway inflammation and hypothalamic-pituitaryadrenal axis achmty in asthmatic mice[J].Phytomedicine, 2014,21(11):1439-1450.

[7] 黄小雅,钟园,黄忠平,等.离子对反相高效液相色谱法同时测定尿液中复方α-酮酸片的5种有效成分[J].色谱,2015,33(2):169-173.

本文编辑：鲁守琴

Simultaneous Determination of Contents of Five Ingredients in Salvia Miltiorrhiza by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography

Hou Chao
(Drug Manufacturing Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Zhengzhou City, Henan Zhengzhou 450000, China)

Objective：To develop a reverse phased high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for simultaneous determination of contents of five ingredients in Salvia miltiorrhiza. Methods：The contents of five ingredients in salvia miltiorrhiza was determined by RP-HPLC using Welchrom C18column (250 mm × 4. 6 mm, 5 μm), serving acetonitrile (A) -0.1% phosphoric acid (B) as mobile phase for gradient elution. Results：The linear ranges of cryptotanshinone, tanshinone IIA, salvianolic acid, danshensu and rosmarinic acid were 0.420 0～16.800 0 µg, 0.414 0～16.560 0 µg, 0.656 0～26.240 0 µg, 0.059 5～2.380 0 µg and 0.346 0～13.840 0 µg respectively, with a r value of 0.999 9, and RSDs of less than 1.2% (n＝6). The mean recovery rates of samples were 98.68%～99.15%. Conclusion：RP - HPLC is accurate, rapid and reproducible, which may be used for determination of liposoluble and water - soluble ingredients in salvia miltiorrhiza and overall qualtiy control of the drug.

Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC); Salvia Miltiorrhiza; Content Determination

R282.71；R927.2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.018

2017 - 04 - 11

侯超，男，硕士，中药师。研究方向：中药制剂与质量控制。通讯作者E-mail：18838195935@163.com