HPLC同时测定祛痰止咳胶囊中3种活性成分含量

毛坤军，黄平，周慧云，叶锡勇

（江西医学高等专科学校药学系，江西 上饶 334000）

HPLC同时测定祛痰止咳胶囊中3种活性成分含量

毛坤军，黄平，周慧云，叶锡勇

（江西医学高等专科学校药学系，江西 上饶 334000）

目的：建立祛痰止咳胶囊中阿魏酸、槲皮素、芹菜素3种活性成分的高效液相色谱法（HPLC）含量测定方法。方法：采用phenomonex®-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%的磷酸水溶液（B）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长为360 nm。结果：阿魏酸、槲皮素、芹菜素在质量浓度分别为0.76～15.2，3.92～76.4，0.59～11.8 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，加样回收率分别为98.48%，101.43%和99.08%。结论：本试验所建立的方法准确、可靠、重复性好，可为祛痰止咳胶囊的质量控制提供科学的依据。

高效液相色谱法；祛痰止咳胶囊；含量测定；质量控制

祛痰止咳胶囊是由《伤寒论》和《金匮要略》中的参夏汤与十枣汤化裁而来，属国家中药保护品种[1]。主要由党参、水半夏、芫花（醋制）、甘遂（醋制）、紫花杜鹃五味中药组成，具有健脾燥湿、祛痰止咳的功效；临床上主要用于慢性支气管炎及支气管炎合并肺气肿、肺源性心脏病所引起的痰多咳嗽、喘息等症[2]。据报道，芫花和紫花杜鹃作为处方中的君药和臣药，具有抗炎和镇咳祛痰作用，其主要化学成分均为黄酮类成分[3-4]，且药效学研究表明黄酮类化合物为其镇咳祛痰的有效成分[5]。目前，祛痰止咳胶囊执行标准为《国家食品药品监督管理局国家药品标准》YBZ02962006-2009Z，其含量测定项下以党参中的阿魏酸为指标成分进行含量测定[6]。鉴于中药复方成分的多样性和复杂性，单一成分难以全面评价和控制药物的内在质量，且作为发挥药效的主要成分，黄酮类化合物还未见相关含量测定的研究报道。故本研究以党参中的阿魏酸、芫花中芹菜素和紫花杜鹃中的槲皮素为指标成分，建立祛痰止咳胶囊中该3种活性成分的HPLC含量测定方法，为进一步提高和完善祛痰止咳胶囊的质量标准提供科学的依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪：包括waters e2489检测器，Empower工作站（美国Waters公司）；CPA225D型电子天平（德国赛多利斯）；KQ-500DE型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；纯水仪（易普易达科技有限公司）。

1.2 试药

对照品：阿魏酸（批号：110773-201012）、芹菜素（批号：100756-201210）、槲皮素（批号：100081-201408）均购自中国药品生物制品检定所，纯度均≥98%；不同批次祛痰止咳胶囊（购自药店）；色谱甲醇购自Merck公司；磷酸、分析甲醇为北京化工产品；水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

phenomonex®-C18色 谱 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.1%的磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，30%～50%A；20～40 min，50%～60%A）；体积流量1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长360 nm，进样量均为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸、槲皮素、芹菜素对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为15.2，76.4，11.8 μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取祛痰止咳胶囊10粒，混匀，研细，取约1.0 g，置锥形瓶中，加入80%甲醇25 mL，称重，超声处理30 min，称重，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 根据处方制备缺党参、紫花杜鹃和芫花的阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别精密吸取对照品、供试品、阴性对照溶液各10 μL，注入HPLC色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析，见图1。结果表明3种被测成分能达到完全分离。

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5，5.0，10.0 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。分别精密吸取10 μL注入HPLC分析，以峰面积Y对进样浓度X进行回归方程计算，结果见表1。

图1 专属性试验HPLC色谱图

表1 3种被测成分的回归方程、线性范围和相关系数

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积并计算RSD。结果显示阿魏酸、槲皮素、芹菜素的RSD分别为1.22%，0.87%，1.88%。表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批号（151203）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样分析，记录峰面积并计算RSD。结果显示阿魏酸、槲皮素、芹菜素的RSD分别为2.04%，1.79%， 2.41%。表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批号（151203）样品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，记录峰面积并计算RSD。结果显示阿魏酸、槲皮素、芹菜素的RSD分别为1.34%，0.89%，2.33%。表明方法重复性良好。

2.3.6 加样回收试验 取已知含量（151203）的样品6份，每份约0.5 g，按1∶1的比例加入对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率，结果见表2。

2.3.7 样品含量测定 取不同批次样品约1.0 g，每个批次平均3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，以外标法计算含量，结果见表3。

表2 加样回收率试验（n＝6）

表3 样品含量测定结果

3 结语

3.1 提取条件的选择

采用单因素变量法对提取方法（超声、回流）；提取溶剂（甲醇、乙醇）；溶剂浓度（60%，80%，100%）；提取时间（30，45，60 min）；料液比（1∶10，1∶25，1∶50）进行考察，结果显示以25倍量80%甲醇超声提取30 min所得含量最佳。

3.2 流动相的选择

由于被测成分均显一定的酸性，故选择酸性系统洗脱，本试验考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液；结果显示，甲醇分离效果优于乙腈，可能是乙腈洗脱效果较强，无法使每个被测成分与相邻色谱峰完全分离，且出于毒性、价格考虑，在环保和成本方面甲醇也更优于乙腈。故试验最终选择甲醇-0.1%磷酸水溶液进行测定。

3.3 检测波长的选择

据文献报道，阿魏酸最大紫外吸收波长为320 nm[7]，槲皮素、芹菜素为360 nm[8]。本实验比较了两种波长下的吸收峰，结果发现在320 nm波长下有较多杂质峰，且槲皮素和芹菜素吸收相对较弱，故最终选择360 nm作为检测波长。

[1] 郭景仙,贺利军,林晓兰.祛痰止咳颗粒临床使用情况分析[J].医药导报,2007,26(6):678-681.

[2] 陈羽鹏,苏连彩,丘建芳,等.RH-HPLC法测定祛痰止咳颗粒中槲皮素的含量[J].中医药导报,2006,12(3):56-57.

[3] 李玲芝,宋少江,高品一.芫花的化学成分及药理作用研究进展[J].沈阳药科大学学报,2007,24(9):587-592.

[4] 栗建明,侯惠婵,隆颖.紫花杜鹃药材质量标准研究[J].今日药学,2011,21(4):229-231.

[5] 郑文燕,王晓东,彭维,等.祛痰止咳颗粒指纹图谱研究[J].中山大学学报:自然科学版,2011,50(3):98-101.

[6] 国家药典委员会.国家食品药品监督管理局国家药品标准[S].YBZ02962006-2009Z.

[7] 云学英,吴宁远,刘晓颖.蒙药耧斗菜中阿魏酸含量的高效液相色谱法测定[J].时珍国医国药,2015,26(3):589-590.

[8] 董爱文,朱春艳,卓琦.五爪龙外敷液中芹菜素与槲皮素的HPLC测定[J].天然产物研究与开发,2014,26(2):230-232,272.

本文编辑：鲁守琴

Simultaneous Determination of Contents of Three Active Components in Qutanzhike Capsules by HPLC

Mao Kun-jun, Huang Ping, Zhou Hui-yun, Ye Xi-yong
(Department of Pharmacy, Jiangxi Medical College, Jiangxi Shangrao 334000, China)

Objective：To develop a HPLC method for determination of three active constituents, i.e. ferulic acid, quercetin and apigenin in qutanzhike capsules. Methods：Phenomonex®-C18chromatographic column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was adopted serving methanol (A)-0.1%phosphoric acid (B) solution as mobile phase at a fow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30℃. The detection wavelength was 360 nm. Results：The linear ranges of ferulic acid, quercetin and apigenin were 0.76～15.2, 3.92～76.4 and 0.59～1.8 μg/mL, while the average recovery rates were 98.48%, 101.43% and 99.08%, respectively. Conclusion：The developed method was accurate, reliable and reproducible, which provided a scientifc basis for the quality control of qutanzhike capsules.

HPLC; Qutanzhike Capsules; Content Determination; Quality Control

R284.1

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.017

2017 - 03 - 05

毛坤军，男，硕士，助教。研究方向：药物质量标准研究。E-mail:737259639@qq.com

叶锡勇，男，学士，教授。研究方向：药物质量标准研究。E-mail:1962628419@qq.com