质粒介导的摩氏摩根菌KL-225对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素的耐药

黄树超，郝雪秦，关艳，邓琪，韩江雪，肖春玲，刘忆霜

质粒介导的摩氏摩根菌KL-225对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素的耐药

黄树超，郝雪秦，关艳，邓琪，韩江雪，肖春玲，刘忆霜

目的研究摩氏摩根菌 KL-225 的超广谱耐药机制，为新型抗菌药物的研发奠定基础。

方法提取纯化摩氏摩根菌 KL-225 的 pKL2683 和pKL5933 质粒，并进行序列测定，将测序结果进行生物信息学分析找到其可能的耐药基因，再通过将质粒转化入摩氏摩根标准菌株和大肠杆菌，对耐药基因进行验证。

结果pKL2683 质粒携带的qnrD基因导致氟喹诺酮类抗生素对 KL-225 的 MIC 升高；pKL5933 质粒携带的aac(6′)-Ib-cr4 基因导致 KL-225 对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素的 MIC 升高。

结论摩氏摩根菌 KL-225 对氨基糖苷类抗生素的耐药主要来源于 pKL5933 质粒上携带的aac(6′)-Ib-cr4 基因；pKL2683 质粒携带的qnrD基因和 pKL5933 质粒携带的aac(6′)-Ib-cr4 基因导致 KL-225 对氟喹诺酮类抗生素敏感性降低。

摩氏摩根菌； 质粒； 氟喹诺酮类耐药； 氨基糖苷类耐药

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2017, 12(4):317-324

细菌耐药问题是 21 世纪最严重的公共健康问题之一，具有复杂耐药机制的革兰阴性（G-）菌耐药问题尤为突出，以表达新德里金属 β-内酰胺酶-1（NDM-1）[1]为特征的“超级细菌”的出现使细菌耐药问题成为了全社会关注的热点。摩氏摩根菌（M.morganii）KL-225 是从病死鲍鱼体内分离得到的“超广谱”、高水平耐药的 G-菌，其对β-内酰胺类（I、II 代固有耐药）、氨基糖苷类、四环素类（固有耐药）、氟喹诺酮类、叶酸抑制剂、氯霉素类、磷霉素类、大环内酯类（非抗阴性菌药物）、林可酰胺类（非抗阴性菌药物）、多肽类等众多抗菌药物的耐药性均有显著提高，且对青霉素、替卡西林、头孢噻吩、环丙沙星、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、氯霉素、磷霉素等抗菌药物表现出高水平耐药[2]。菌株M.morganiiKL-225 的耐药谱已超过了通常意义的多药耐药，因此可称之为“超级”耐药菌，推测该菌株具有多种耐药机制。深入研究和阐明M.morganiiKL-225 的超广谱耐药机制，评价以此菌株作为模式菌株的可行性，对于筛选和研制新型抗菌药物具有重要意义。

在提取 KL-225 基因组的过程中，发现KL-225 携带了多个质粒，推测这些质粒的存在可能与其耐药性有关。因此，我们率先从提取其携带的质粒入手，研究 KL-225 的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株M.morganiiKL-225 由福建水产研究所从病死鲍鱼体内分离和保存，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，编号 CGMCC3655，保藏日期 2010年 3月10日。M.morganii标准菌株 ATCC25830 购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）。

1.1.2 培养基 MH 固体培养基：牛肉浸粉 6 g、可溶性淀粉 1.5 g、酸水解酪蛋白胨 17.5 g、琼脂13 g，pH（7.4 ± 0.2），定容至 1000 ml；MH 肉汤培养基：牛肉浸粉 6 g、可溶性淀粉 1.5 g、酸水解酪蛋白胨 17.5 g、pH（7.4 ± 0.1），定容至 1000 ml；LB 液体培养基：胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化钠 10 g，pH 7.4，定容至 1000 ml。

1.1.3 试剂 所有抗菌药物购于中国食品药品检定研究院；T 载体（T-Vector PMD19 Simple）试剂盒购于日本 Takara 公司；感受态细胞E.coliDH5α购于北京全式金生物有限公司；DNA 超螺旋marker 购于日本 Takara 公司和美国 NEB 公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购于德国 Qiagen公司。

1.1.4 器材及仪器 超净工作台 BCM-1000A 为江苏苏净公司产品；高压灭菌锅 mlS-3750 和超低温冰箱 MDF-U32865 为日本 Sanyo 公司产品；高速微量台式离心机 Legend Micro 17、紫外分光光度仪 Biomate 3S 和高速冷冻离心机 Legend Mach 1.6R 为美国 Thermo 公司产品；DNAEngine PCR 仪、BASIC 电泳仪、MicroPulser 电击转化仪和 XR+凝胶成像仪为美国 Bio-Rad 公司产品；WD-9403D 型紫外仪和 WD-2101 型电泳系统为北京六一仪器厂产品；DHP-420 型电热恒温培养箱为北京市永光明医疗仪器厂产品；Innova 43 温控摇床为美国 New Brunswich 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养 挑取M.morganiiKL-225 单菌落接种在 LB 液体培养基中，37 ℃、200 r/min 条件下培养至对数生长期（OD600≈ 0.6）。

1.2.2 质粒提取与纯化 用质粒提取试剂盒提取M.morganiiKL-225 质粒，并用胶回收试剂盒纯化pKL2683 和 pKL5933。

1.2.3 测序 通过限制性内切酶Sau3AI 将质粒消化为小片段，并随机克隆测序，以测出序列为模板设计引物，双方向扩增质粒，将扩增产物连接到T 载体中进行测序。

1.2.4 生物信息学分析 利用 BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）和 ORF Finde（rhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）对测序结果进行生物信息学分析。

1.2.5 测定固体平板上卡那霉素和环丙沙星对M.morganii标准菌株的 MIC 将抗菌药物配制成浓度为 25.6 mg/ml 的母液，然后将配制好的 20 ml MH 琼脂培养基在微波炉中加热至完全溶解，待凉至约 45 ℃（保持液态）；分别加入 200、100、50、25、12.5、6.25 μl 浓度为 25.6 mg/ml 的抗菌药物至 20 ml 仍保持液态的 MH 琼脂培养基中，充分混匀，制成浓度为 256、128、64、32、16、8 μg/ml的含有抗菌药物的 MH 琼脂培养基，分别倒入培养皿中冷却凝固，约 20 ml/培养皿。实验结果表明，在固体平板上，卡那霉素对M.morganii标准菌株的 MIC 为 32 μg/ml；环丙沙星对M.morganii标准菌株的 MIC 为 0.0625 μg/ml。

1.2.6 电击转化 用M.morganii标准菌株制作感受态细胞，将 pKL2683 和 pKL5933 电击转入M.morganii标准菌株，转化菌株分别命名为M.m(pKL2683) 和M.m(pKL5933)，分别用含有环丙沙星（0.125 μg/ml）和卡那霉素（64 μg/ml）的 MH 琼脂培养基进行筛选，在 37 ℃ 恒温培养箱中培养 24 h；观察细菌生长情况，有菌落生长的判为阳性转化菌。

1.2.7 阳性转化菌验证 用质粒提取试剂盒提取M.m(pKL2683) 和M.m(pKL5933) 的质粒。

1.2.8 在E.coli中验证耐药基因 分别从pKL2683 的qnrD基因内部和qnrD基因以外的位置扩增 pKL2683，保证qnrD基因的断裂与完整（图 1 和图 2），并连接到 T 载体上转化入E.coli，从qnrD基因内部克隆的转化菌株命名为E.coli(T-pKL2683*)，从qnrD基因外部克隆的转化菌株命名为E.coli(T-pKL2683)；分别从 pKL5933的aac(6′)-Ib-cr4 基因内部和aac(6′)-Ib-cr4 基因以外的位置扩增 pKL5933，保证aac(6′)-Ib-cr4 基因的断裂与完整（图 3 和图 4），并连接到 T 载体上转化入E.coli，从aac(6′)-Ib-cr4 基因内部克隆的转化菌株命名为E.coli(T-pKL5933*)，从aac(6′)-Ib-cr4 基因外部克隆的转化菌株命名为E.coli(T-pKL5933)。

图1 从qnrD基因内部扩增 pKL2683 并连接到 T 载体上Figure 1 pKL2683 was amplified fromqnrDgene and connected to the T-Vector PMD19

图2 从 qnrD 基因以外的位置扩增 pKL2683 并连接到 T 载体上Figure 2 pKL2683 was amplified from the position outside of the qnrD gene and connected to the T-Vector PMD19

图3 从 aac(6′)-Ib-cr4 基因内部扩增 pKL5933 并连接到 T 载体上Figure 3 pKL5933 was amplified from aac(6′)-Ib-cr4 gene and connected to the T-Vector PMD19

图4 从 aac(6′)-Ib-cr4 基因以外的位置扩增 pKL5933 并连接到 T 载体上Figure 4 pKL5933 was amplified from the position outside of the aac(6′)-Ib-cr4 gene and connected to the T-Vector PMD19

1.2.9 微孔法测定各种抗菌药物对各转化菌株和M.morganii标准菌株的 MIC 将 96 孔板、U 型槽等在紫外灯下照射 30 min 灭菌；将菌株的培养液用新鲜的 MH 液体培养基稀释，使其终浓度约为 1.5 × 105cfu/ml；用排式微量移液器将新鲜培养的菌液加入到 96 孔板中，第 1 排 198 μl，2～12 排每孔 100 μl；于第 1 排每孔加入浓度为25.6 mg/ml 的抗菌药物 2 μl 混匀，使混合液中药物浓度为 256 μg/ml；从第 1 排吸取 100 μl 液体加入到第 2 排中混匀，使混合液中药物浓度为128 μg/ml；2～12 排按上述步骤方法，使抗菌药物浓度依次 2 倍递减，第 12 排浓度为 0.125 μg/ml（环丙沙星第 1 排的浓度为 64 μg/ml，第 12 排浓度为 0.3125 μg/ml）；将 96 孔板放置在 37 ℃恒温培养箱中培养 18 h；观察结果，以细菌生长完全受抑制的最小浓度记为最低抑菌浓度（MIC 值）。

2 结果

2.1 M.morganii KL-225 质粒电泳图

由图 5 可知，M.morganiiKL-225 含有 5 个质粒。

2.2 生物信息学分析结果

pKL2683 大小为 2683 bp，G+C 含量 41.8%，携带氟喹诺酮类耐药基因qnrD以及 3个功能未知的 ORF 区（图 6）；pKL5933 大小 5933 bp，G+C 含量 51.0%，携带氨基糖苷 N(6')-乙酰转移酶基因aac(6′)-Ib-cr4。pKL5933 与最早报道的鼠伤寒沙门菌 DT104B 携带的 pMdT1 质粒[3]一致性为 99.85%，与 pMdT1 相比，pKL5933 在aac(6′)-Ib-cr4 基因区域以外有 9 个碱基变化（图 7）。

图5 M.morganiiKL-225 质粒电泳图Figure 5 M.morganiiKL-225 plasmids profile

图6 pKL2683 质粒图谱Figure 6 pKL2683 plasmid profile

2.3 pKL2683 和 pKL5933 转化菌验证

如图 8 可知，质粒 DNA 在 marker 指示下DNA 大小在 2～3 kb 之间并接近 3 kb，符合实验设计，测序后确定 pKL2683 已经成功转入M.morganii标准菌株中。

如图 9 可知，质粒 DNA 在 marker 指示下约为 6 kb，符合实验设计，测序后确定 pKL5933已经成功转入M.morganii标准菌株中。

2.4 测定多种类型抗菌药物对各种转化菌和标准菌的 MIC 值

比较各种抗菌药物的耐药性差异，结果如表 1～ 4。在测定细菌 MIC 时，2 倍之内的 MIC 值差异在误差范围之内。在比较药物对两种细菌的 MIC差异时，4 倍以上的差异判定为耐药性显著改变。

与M.morganii标准菌株相比，氟喹诺酮类的环丙沙星对M.m(pKL2683) 的 MIC 值有显著提高，说明 pKL2683 导致M.morganiiKL-225 对氟喹诺酮类抗生素的敏感性降低（表 1）。

图7 pKL5933 质粒图谱Figure 7 pKL5933 plasmid profile

图8 pKL2683 转化菌验证电泳图Figure 8 Validation of pKL2683 transformants

图9 pKL5933 转化菌验证电泳图Figure 9 Validation of pKL5933 transformants

与M.morganii标准菌株相比，氟喹诺酮类的环丙沙星和氨基糖苷类的卡那霉素与阿米卡星对M.m(pKL5933) 的 MIC 值有显著提高，说明pKL5933 导致M.morganiiKL-225 对氨基糖苷类抗生素耐药并对氟喹诺酮类抗生素的敏感性降低（表 2）。

由表 3 可知，与E.coli(T-pKL2683*) 相比，环丙沙星对E.coli(T-pKL2683) 的 MIC 有显著提高，而其他类型抗生素的 MIC 没有变化，说明pKL2683 携带的qnrD基因导致M.morganiiKL-225 对喹诺酮类抗生素的敏感性降低。

表1 各种抗菌药物对 M.m (pKL2683) 和 M.morganii 标准菌株的 MIC（μg/ml）Table 1 MIC of the M .m (pKL2683) and standard M.morganii bacteria against various antimicrobial agents (μg/ml)

由表 4 可知，与E.coli(T-pKL5933*) 相比，卡那霉素对E.coli(T-pKL5933) 的 MIC提高了32 倍以上，而其他类型抗生素的 MIC 没有变化，说明 pKL5933 携带的aac(6′)-Ib-cr4 基因导致M.morganiiKL-225 对氨基糖苷类抗生素的耐药。

3 讨论

细菌对抗生素的耐药性日益严重，由细菌耐药引起的死亡人数在逐年增加[4]。然而与细菌耐药性不断出现相对的是新型抗菌药物的匮乏[5-7]。M.morganiiKL-225 是超广谱耐药菌，以此作为抗菌药物筛选的模式菌株，可以排除被其耐药的已知类型抗菌活性化合物，从而增加了获得新结构、新机制的抗 G-耐药菌药物的可能性。本研究旨在通过耐药机制的研究，阐明 KL-225 作为模式菌株的可行性。

本阶段对其携带的 2 个质粒进行了深入研究，明确了这 2 个质粒携带的耐药基因，并通过实验证明了 pKL2683 质粒携带的qnrD基因和 pKL5933 质粒携带的aac(6′)-Ib-cr4 基因与M.morganiiKL-225 对于氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素的耐药密切相关。值得注意的是，质粒pKL2683 与在奇异变形杆菌中发现的质粒pM510[8]高度同源（在qnrD基因以外的位置仅有1 个碱基差异），一致性为 99.99%；其他肠杆菌科中也存在着与 pKL2683 高度同源的质粒，如雷氏普罗威登斯菌携带的两个质粒 pDIJ09-518a 和pGHS09-09a[9]，与 pKL2683 的一致性分别为99.85%（在qnrD基因以外的位置有 4 个碱基差异）和 99.78%（在qnrD基因以外的位置有 6 个碱基差异）。这些质粒可能来源于同一亲本菌株，是原质粒在菌株间穿梭的过程中形成的不同的变体。在其他肠杆菌科中也存在着与 pKL5933 高度同源的质粒，如：鼠伤寒沙门菌 DT104B 携带的pMdT1[3]质粒与 pKL5933 的一致性为 99.85%（在aac(6′)-Ib-cr4 基因以外的位置有 9 个碱基差异），pMdT1 宿主菌株对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素的耐药性与 pKL5933 转化菌一致；在阴沟肠杆菌 CY01 中也发现了与 pKL5933 的一致性为99.93%（在aac(6′)-Ib-cr4 基因内部有 4 个碱基差异）的质粒 pCY-MdT[10]。说明该质粒能在不同的肠杆菌科细菌中穿梭并传播耐药性，除了肠杆菌科细菌外，此类型的质粒能否在其他类型细菌中复制和穿梭，有待进一步的实验证明。

表2 各种抗菌药物对M.m(pKL5933) 和M.morganii标准菌株的 MIC（μg/ml）Table 2 MIC of theM.m(pKL5933) and standardM.morganiibacteria against various antimicrobial agents (μg/ml)

表3 各种抗菌药物对E.coli(T-pKL2683*) 和E.coli(T-pKL2683) 的 MIC（μg/ml）Table 3 MIC of theE.coli(T-pKL2683*) andE.coli(T-pKL2683) against various antimicrobial agents (μg/ml)

表4 各种抗菌药物对E.coli(T-pKL5933*) 和E.coli(T-pKL5933) 的 MIC（μg/ml）Table 4 MIC of theE.coli(T-pKL5933*) andE.coli(T-pKL5933) against various antimicrobial agents (μg/ml)

本研究仅仅阐明了 2 个质粒介导了M.morganiiKL-225 对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素的耐药，而M.morganiiKL-225 具有超广谱的耐药性，表明了在M.morganiiKL-225 基因组和其余质粒中可能还存在着其他的耐药机制。在后续研究中通过对M.morganiiKL-225 和M.morganii标准菌株 ATCC25830 基因组序列进行比对，对差异序列进行生物信息学分析，推测可能耐药相关基因并在E.coli和M.morganii标准菌株中克隆表达来验证其耐药相关性。对于M.morganiiKL-225其余质粒的研究，较小质粒的测序方法同 pKL2683和 pKL5933 质粒，较大的质粒需要对其进行高通量测序，将测序结果进行生物信息学分析找到其可能的耐药相关基因，通过本研究类似方法来验证其耐药相关性。通过这些研究对M.morganiiKL-225的耐药机制展开深入研究，阐明其复杂的耐药机制。

另一方面，以M.morganiiKL-225 为模式菌株进行筛选，可提高新结构、新机制抗菌活性化合物的筛选效率。因此在对M.morganiiKL-225 的耐药机制加以阐明之后，以M.morganiiKL-225 为模式菌株构建抗多药耐药 G-菌药物筛选模型，筛选出对M.morganiiKL-225 具有良好抑菌活性，且不被M.morganiiKL-225 耐药（对M.morganiiKL-225与M.morganii标准菌株 ATCC25830 活性无显著差异）的化合物，通过成药性研究，可能从中获得具有良好成药前景的新型抗多药耐药 G-菌候选药物；同时，利用诱导耐药突变、蛋白质组芯片等方法对这些候选药物进行作用靶标的研究，将获得全新的抗 G-菌药物靶标，为具有全新机制的抗G-菌药物的研发奠定基础。

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刘忆霜, 郝雪秦, 关艳, 等.以“广谱耐药”的摩氏摩根菌为模式菌株的筛选模型的建立及应用.中国抗生素杂志, 2015, 40(11):801-807.

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(4):317-324

第十届中国生物产业大会在广州开幕

7月 3日，第十届中国生物产业大会在广州开幕，此次大会主题为“促进生物产业新发展，培育生物经济新动能”，来自全球百位顶尖专家在高层论坛和 16 个专业分论坛上针对各自细分领域进行专业探讨。中央政治局委员、广东省委书记胡春华同志出席了开幕式。

其中，由我会主办、多赢时代转化医学研究院协办的“再生医学与健康产业高峰论坛”在白云国际会议中心 4 号楼一楼清远厅举办。本次论坛邀请到日本再生医学论坛（FIRM 协会）和国内有关专家就“再生医学与健康产业”等专业问题进行了深入交流。协会李少丽副理事长和吴朝晖秘书长出席会议。

Plasmids-mediated aminoglycosides resistance and fluoroquinolones resistance in Morganella morganii KL-225

HUANG Shu-chao, HAO Xue-qin, GUAN Yan, DENG Qi, HAN Jiang-xue, XIAO Chun-ling, LIU Yi-shuang

ObjectiveTo study the mechanisms of broad-spectrum resistance inM.morganiiKL-225 and lay foundation for the development of novel antibacterial drugs.

MethodspKL2683 and pKL5933 inM.morganiiKL-225 were extracted and purified, then sequenced.Bioinformatics analysis was performed on the sequencing results to find out possible resistance-related genes.The plasmids were transferred into theM.morganiistandard strains and resistance genes were expressed inEscherichia colifor verification.

ResultsqnrDgene carried by pKL2683 increased the fluoroquinolones MICs for KL-225; The pKL5933 plasmid carriesaac(6')-Ib-cr4gene, which increased the aminoglycosides and fluoroquinolones MICs for KL-225.

ConclusionM.morganiiKL-225 is resistant to aminoglycosides mainly because of the pKL5933 plasmid which carries theaac(6′)-Ib-cr4 gene.Theaac(6′)-Ib-cr4 gene carried by pKL5933 plasmid andqnrDgene carried by pKL2683 plasmid decreased the susceptibility to fluoroquinolones in KL-225.In order to completely clarify the mechanisms of broad-spectrum resistance inM.morganiiKL-225, it is necessary to study the genome and other plasmids.

Morganella morganii; Plasmid; Resistance to fluoroquinolones; Resistance to aminoglycosides

LIU Yi-shuang, Email: yishuang@gmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.005

国家高技术研究发展计划（863计划）青年科学家专题（2015AA020911）；国家自然科学基金青年科学基金（81102353）

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药（微生物）筛选实验室

刘忆霜，Email：yishuang@gmail.com

2017-04-27

Author Affiliation:Department of National Laboratory for Screening New Microbial Drugs, The Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China