改良快速Carba NP试验检测碳青霉烯酶的应用价值

于宏伟，何京，程阔，马伟立，杨子轩，冯军花，张金艳

(河北医科大学第四医院检验科，石家庄 050000)

·临床检验技术研究·

改良快速Carba NP试验检测碳青霉烯酶的应用价值

于宏伟，何京，程阔，马伟立，杨子轩，冯军花，张金艳

(河北医科大学第四医院检验科，石家庄 050000)

目的 探讨改良快速Carba NP试验用于检测碳青霉烯酶的可行性，并对比分析其与Carba NP试验的差异。方法 选取264株革兰阴性杆菌，其中耐药菌株164株，敏感菌株100株。分别采用Carba NP试验、改良快速Carba NP试验检测碳青霉烯酶表型，并以PCR检测结果为参比，评价上述检测方法的差异。结果 164株耐药菌株中，耐药基因阳性144株；100株敏感菌株耐药基因均为阴性。164株耐药菌株中Carba NP试验阳性135株；改良快速Carba NP试验阳性130株。100株敏感菌株中，2种方法均为阴性。与PCR检测结果相比，Carba NP试验的敏感性和特异性分别为91.7%(132/144)和97.5%(117/120)，Kappa值0.886；改良快速Carba NP试验敏感性和特异性分别为89.6%(129/144)和99.2%(119/120)，Kappa值0.879。Carba NP试验与改良快速Carba NP试验的阳性检出率差异无统计学意义(χ2=1.45，P>0.05)。结论 改良快速Carba NP试验与PCR方法一致性高，较Carba NP试验更为快速、廉价，适用于流行病学调查和院内感染的早期监测。

Carba NP试验；改良快速Carba NP试验；碳青霉烯酶

美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2015年标准推荐Carba NP试验用于肠杆菌科细菌和非发酵菌碳青霉烯酶表型筛选，具有较高的敏感性和特异性，且将检测时间缩短至2 h[1]。2017年CLSI推荐改良碳青霉烯酶灭活法(mCIM)用于肠杆菌科细菌检测，无需特殊试剂，结果客观易于观察，但所需温育时间较长[2]。快速Carba NP试验由Srisrattakarn等[3]提出，对受试菌株的处理过程由研磨代替温育，在保证Carba NP试验高敏感性和特异性的同时将检测时间由2 h缩短至15 min，提高了检测效率。本研究在快速Carba NP试验的基础上增加5 mol/L NaCl溶液[4](简称为改良快速Carba NP试验)，探讨其在检测产碳青霉烯酶菌株中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集河北医科大学第四医院2014年1月至2016年8月临床分离菌株264株，其中碳青霉烯类耐药菌株164株(亚胺培南或美罗培南最低抑菌浓度≥4 μg/mL)，敏感菌株100株(亚胺培南、美罗培南均敏感)。其中肺炎克雷伯菌69株(敏感菌株25株，耐药菌株44株)、大肠埃希菌60株(敏感菌株25株，耐药菌株35株)、鲍曼不动杆菌68株(敏感菌株25株，耐药菌株43株)、铜绿假单胞菌67株(敏感菌株25株，耐药菌株42株)。所有菌株均由Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪进行鉴定和药物敏感试验，药敏结果采用纸片扩散法进行复核。肺炎克雷伯菌ATCC 1705为阳性对照，大肠埃希菌ATCC 25922及铜绿假单胞菌ATCC 27853为阴性对照，均购自美国MicroBiologics 公司。

1.2 主要仪器及试剂 Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪及配套GN、AST-GN09卡片(法国生物梅里埃公司)；M-H琼脂培养基(郑州安图生物公司)；细菌总蛋白质抽提试剂(美国Thermo公司)；亚胺培南西司他丁钠(上海海正辉瑞公司)；ZnSO4·7H2O粉末(美国Sigma公司)；酚红粉末(美国Amresco公司)；PCR扩增仪、2×Taq PCR Master Mix(美国ABI公司)；电泳仪(法国西比亚公司)；PCR引物由上海生工公司合成；细菌基因组DNA提取试剂(北京天根生物公司)。

1.3 Carba NP试验[5-6]用1 μL接种环从37 ℃培养24 h血平板上挑取受试菌株，加入装有100 μL细菌总蛋白质抽提液的1.5 mL离心管中，振荡混匀5 s，制备2管分别标记A、B。将100 μL A液(含0.1 mmol/L硫酸锌的酚红溶液，pH值调至7.8±0.1)、100 μL B液(A液中加入6 mg/mL亚胺培南西司他丁钠，pH值调至7.8±0.1)，分别加入上述微量离心管中，37 ℃温育2 h。若受试菌株产碳青霉烯酶，水解亚胺培南释放H+，使溶液pH降低，酚红指示剂由红变黄。反之指示剂不变色。肺炎克雷伯菌ATCC 1705和大肠埃希菌ATCC 25922分别作为阳性对照和阴性对照。

1.4 改良快速Carba NP试验 用1 μL接种环从37 ℃培养24 h M-H平板上挑取受试菌株，分别在滴加50 μL检测液A(含0.1 mmol/L硫酸锌、5 mmol/L NaCl的酚红溶液，pH值调至7.8±0.1)和滴加50 μL检测液B(A液中加入6 mg/mL亚胺培南西司他丁钠、pH值调至7.8±0.1)的纸片上充分研磨，15 min内观察结果。若受试菌株产碳青霉烯酶则在研磨过程中检测液由红变黄，反之，检测液不变色。肺炎克雷伯菌ATCC 1705和大肠埃希菌ATCC 25922作为阳性对照和阴性对照。

1.5 PCR扩增耐药基因 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA并作为模板。参照文献[7]合成A类碳青霉烯酶基因blaKPC、blaSME、blaGES、blaIMI，B类碳青霉烯酶基因blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaSPM、blaGIM和D类碳青霉烯酶基因blaOXA-48、blaOXA-24、blaOXA-23。引物由上海生工公司合成，见表1。PCR扩增体系50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，模板4 μL，10 pmol/μL上、下游引物各2 μL，ddH2O 17 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，退火温度(见表1)下60 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。所得产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察，目的片段纯化后由上海生工公司双向测序，用BLAST软件与GenBank上已公布的基因序列进行比对。

表1 耐药基因引物序列

1.6 统计学分析 用SPSS 21.0软件进行。Carba NP试验、改良快速Carba NP试验同PCR检测结果行一致性检验，Kappa值>0.75一致性较好；Carba NP试验与改良快速Carba NP试验的阳性检出率比较采用McNemarχ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药基因检测 164株耐药菌株中，耐药基因阳性为144株，阴性为20株。其中，肺炎克雷伯菌中检出blaKPC-2型39株，blaNDM-1型5株；大肠埃希菌中35株均为blaNDM-1型；鲍曼不动杆菌中检出blaOXA-23型28株，15株耐药基因阴性；铜绿假单胞菌中blaIMP-4型20株，blaVIM-2型17株，5株为耐药基因阴性；100株敏感菌株中耐药基因均为阴性，见表2。

表2 Carba NP试验与改良快速Carba NP试验结果比较

2.2 Carba NP试验、改良快速Carba NP试验检测碳青霉烯酶的结果分析 164株耐药菌株中，Carba NP试验阴性29株，阳性135株，存在15株表型与基因不一致，其中12株表型阴性而基因检测阳性，3株基因阴性而表型阳性。改良快速Carba NP试验阴性34株，阳性130株，存在16株表型与基因不一致，15株耐药基因阳性而表型阴性，1株为耐药基因阴性而表型阳性。见表3。100株敏感菌中，Carba NP试验、改良快速Carba NP试验均为阴性。以耐药基因扩增为金标准，Carba NP试验阳性135株，阴性129株，敏感性和特异性分别为91.7%(132/144)、97.5%(117/120)，Kappa值0.886；改良快速Carba NP试验阳性130株，阴性134株，敏感性和特异性分别为89.6%(129/144)、99.2%(119/120)，Kappa值0.879。见表2。Carba NP试验与改良快速Carba NP试验阳性率差异无统计学意义(χ2=1.45，P=0.227)。

表3 Carba NP试验、改良快速Carba NP试验检测结果分析

3 讨论

本研究采用的改良快速Carba NP试验在Carba NP试验原理的基础上，用研磨法代替温育受试菌株，通过在高渗性检测液中充分研磨受试菌株，促使菌体破坏，加快碳青霉烯酶的释放速度[4]，将反应时间缩短至15 min，提高了检测效率；同时减少了试剂用量，去除了细菌总蛋白质抽提步骤，节约了检测成本。改良快速Carba NP试验在与PCR方法的一致性检验中，Kappa值虽稍低于Carba NP试验，但仍大于0.75，一致性良好，敏感性和特异性均大于85%。Carba NP试验将待测菌株同细菌总蛋白质抽提试剂混合后，与检测液共同温育2 h，增加了碳青霉烯酶的利用率，相比改良快速Carba NP试验，其敏感性稍高，但2种检测方法阳性率差异无统计学意义。

本研究发现，肠杆菌科细菌中，5株肺炎克雷伯菌和2株大肠埃希菌Carba NP试验假阴性；6株肺炎克雷伯菌和2株大肠埃希菌改良快速Carba NP试验假阴性。其中包括3株黏液型肺炎克雷伯菌，两方法均出现假阴性。有文献表明，黏液型菌株易导致Carba NP试验假阴性结果[8]。此外，可能存在弱产酶菌株或产酶活性较差菌株[9]，pH改变较小，颜色变化不明显，从而导致两表型试验均出现假阴性。有1株肺炎克雷伯菌两试验检测结果不一致，其原因可能与Carba NP试验温育时间长，敏感性稍高于改良快速Carba NP试验相关。非发酵菌中，2株鲍曼不动杆菌和3株铜绿假单胞菌Carba NP试验假阴性，4株鲍曼不动杆菌和3株铜绿假单胞菌改良快速Carba NP试验假阴性。本研究中鲍曼不动杆菌的产酶类型主要为D类酶，D类酶水解活性较弱，且Carba NP试验所用缓冲液缓冲作用强，所以易出现假阴性[4]。改良快速Carba NP试验用5 mol/L NaCl溶液代替裂解缓冲液，可能导致其较Carba NP试验假阴性菌株稍多。此外，研究中存在6株铜绿假单胞菌两种表型试验检测结果不一致，其中包括3株黏液型铜绿假单胞菌，因不利于研磨而导致改良快速Carba NP试验假阴性。其余结果不一致菌株可能与两方法的敏感性、特异性，菌落自身性质及琼脂类型相关[10]。改良快速Carba NP试验选用M-H平板，与Srisrattakarn等[3]研究一致。本研究也尝试用血平板进行试验，但结果多为阴性，具体机制不明。此外，研究中存在部分非发酵菌对碳青霉烯类抗生素耐药，但基因及产酶表型检测均为阴性，其具体耐药机制仍需进一步研究。本研究存在基因检测为阴性但对碳青霉烯类抗生素耐药，表型检测均为阳性的铜绿假单胞菌1株，仅Carba NP试验阳性的鲍曼不动杆菌2株，提示本研究可能在基因检测的全面性方面尚存不足，需后续研究予以完善。

改良快速Carba NP试验可应用于大批量的流行病学调查，但尚不能用于检测产酶表型。

[1]孙长贵, 成军, 杨燕. 2015年CLSI M100-S25文件主要更新内容解读[J]. 临床检验杂志, 2015, 33(4): 241-245.

[2]程阔, 于宏伟, 马伟立, 等. imCIM检测B类碳青霉烯酶的效果评价[J]. 临床检验杂志, 2017, 35(1): 31-35.

[3]Srisrattakarn A, Lulitanond A, Wilailuckana C,etal. Modification and evaluation of the Carba NP test by use of paper strip for simple and rapid detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2016, 32: 117.

[4]Dortet L, Poirel L, Errera C,etal. CarbAcineto NP test for rapid detection of carbapenemase-produingAcinetobacterspp.[J]. J Clin Microbiol, 2014, 5(7): 2359-2364.

[5]Nordmann P, Poirel L, Dortet L. Rapid detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae [J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(9): 1503-1507.

[6]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standands for antimicrobial susceptibility testing: Twenty-fifth informational supplement. CLSI document M100-S25[S]. Wayne, PA: CLSI, 2015.

[7]Pasanen T, Koskela S, Mero S,etal. Rapid molecular characterization ofAcinetobacterbaumanniiclones with rep-PCR and evaluation of carbapenemase genes by new multiplex PCR in hospital district of Helsinki and Uusimaa[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e85854．

[8]Yamada K, Kashiwa M, Arai K,etal. Comparison of the Modified-Hodge test, Carba NP test, and carbapenem inactivation method as screening methods for carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. J Microbiol Methods, 2016, 128:48-51.

[9]曹蕾, 李小月, 周万青, 等. CIM和Carba NP筛选肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的比较[J]. 临床检验杂志, 2016, 34(9): 646-649.

[10]Hombach M, Von GB, Castelberg C,etal. Evaluation of the rapid Carba NP test for detection of carbapenemases in Enterobacteriaceae[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(12): 3828-3833.

(本文编辑：周万青，刘群)

Application value of modified rapid Carba NP test for the detection of carbapenemase-producing strains

YUHong-wei,HEJing,CHENGKuo,MAWei-li,YANGZi-xuan,FENGJun-hua,ZHANGJin-yan

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,Hebei,China)

Objective To investigate the feasibility of modified rapid Carba NP test for the detection of carbapenemase, and analyze the differences between the modified method and Carba NP test. Methods A total of 264 strains of gram-negative bacillus, including 164 carbapenem-resistant strains and 100 sensitive strains, were collected, and their carbapenemase were detected by Carba NP test and the modified rapid Carba NP test, respectively. The differences between the two tests were evaluated based on PCR as a reference. Results Among 164 carbapenem-resistant strains, carbapenemase gene was detected in 144 strains by PCR. The carbapenemase gene was negative in 100 sensitive strains. Among 164 carbapenem-resistant strains, 135 were positive for the Carba NP test, while 130 for the modified rapid Carba NP test. One hundred of sensitive strains were negative for the two Carba NP tests. Compared with the results of PCR, the sensitivity, specificity andKappavalue of the Carba NP test were 91.7%(132/144), 97.5%(117/120) and 0.886, respectively, while those of the modified rapid Carba NP test were 89.6%(129/144), 99.2%(119/120) and 0.879, respectively. There was no significant difference in the positive rates between Carba NP test and the modified rapid Carba NP test(χ2=1.45,P>0.05). Conclusion The modified rapid Carba NP test which has high consistency with the PCR method，is faster and cheaper than the Carba NP test, and may be applied to epidemiologic survey and the early monitoring of nosocomial infections.

Carba NP test; modified rapid Carba NP test; carbapenemase

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.03

河北省卫生厅重点科技研究计划基金(20150332)。

于宏伟，1993年生，女，硕士研究生，从事临床检验诊断学研究。

张金艳，主任技师，E-mail：jinyanzhang66@163.com。

R446.5

A

2017-05-03)