不同结核杆菌检测方法的临床应用价值

王江峰，石 梁，夏建新

（红安县人民医院，湖北 黄冈 438400）

不同结核杆菌检测方法的临床应用价值

王江峰，石 梁，夏建新

（红安县人民医院，湖北 黄冈 438400）

目的探讨罗氏培养、荧光聚合酶链反应技术（PCR）、痰涂片试验、增菌聚合酶链反应技术（PCR）四种检测方法对结核杆菌检测的临床应用价值。方法选取我院2015年6月～2016年6月收治的结核病患者60例分为观察组，将同期收治的非结核病患者40例作为对照组。采集所有患者的痰液标本先后进行罗氏培养、PCR技术、痰涂片试验、增菌PCR技术检测，记录检测结果，比较不同检测方法的检测价值。结果观察组患者检测结果显示，罗氏培养检出痰液标本阳性14例，阳性率为23.33%；PCR技术检出痰液标本阳性33例，阳性率为55.00%；痰涂片试验检出痰液标本阳性19例，阳性率为31.67%；增菌PCR技术检出痰液标本阳性40例，阳性率为66.67%。对照组患者检测结果显示，四种检测方法对痰液标本阳性检出率均为0。增菌PCR技术对痰液标本阳性检出率＞PCR技术＞罗氏培养＞痰涂片试验，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论临床检测结核杆菌的方法众多，增菌PCR技术、PCR技术对结核杆菌的特异性强，敏感度高，操作简单，检测时间短，适合作为对结核杆菌检测的实验室首选检测方法。

罗氏培养；PCR技术；痰涂片试验；增菌PCR技术；结核杆菌检测

结核病是一种因感染结核杆菌（TB）引起的慢性疾病，具有强传染性。会侵犯主要脏器，引起肺结核、结核性胸膜炎、肾结核等多种疾病，不同发病阶段的症状有所差异，增加了诊断难度[1]。我国是肺结核高负担国家，结合病患者人数已经超过千万，且25%的结核病患者具有传染性。不仅增加了患者的痛苦，给患者及其家庭带来了巨大的经济压力，还威胁他人安全，成为社会公共卫生问题。尽早明确诊断，及时规范治疗多数患者可以治愈。实验室结核杆菌检测方法众多，寻找检测特异性强，操作简单、快捷的检测方法是临床关注的重点[2]。本文就增菌PCR技术、罗氏培养、PCR技术、痰涂片试验对TB检测情况进行探讨，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2015年6月～2016年6月收治的60例结核病患者（观察组）及同期收治的40例非结核病患者（对照组）。观察组中男38例，女22例，年龄38～72岁，平均（54.6±4.1）岁。所有患者均符合中华医学会结核病学分会关于结核病的诊断标准，患者均签署《知情同意书》。对照组中男25例，女15例，年龄36～71岁，平均（54.3±4.0）岁，疾病类型：支气管肺炎20例，间质性肺炎9例，细菌性肺炎5例，肺癌4例，肺脓疡2例。

1.2 方法

1.2.1 检测材料

在患者入院后次日清晨，分别采集两组患者的痰液标本进行TB检测。培养基为本院自制的酸性改良罗氏培养基，液体培养基为美国Becton Dickinson公司提供的Middlebrook 7H9液体培养基+10% OADC营养添加剂。不同结合杆菌标准菌株由上海肺科医院实验室提供，结合杆菌试剂盒由博奥生物有限公司负责提供。PCR扩增试剂盒由上海生工生物工程股份有限公司提供，严格按照实验室检验标准进行操作。

1.2.2 检测方法

痰涂片、罗氏培养：用4%氢氧化钠将痰液标本进行液化后加入PBS，在离心机中以3000 r/min的速离心5 min，去除上清液。PBS重悬后再次离心5 min，洗涤两次后沉淀。用PBS重悬、混匀后吸出0.1 mL，依次进行增菌PCR、罗氏培养、PCR、痰涂片试验。

PCR：将0.1 mL处理后的待检标本进行裂解液（蛋白酶K+Chelex）提取DNA，取一直单管PCR反应管，依次加入样品、阴性质控品、2 μL阳性质控品。在离心机中以8000 r/min的速离心10 s后放入PCR仪。PCR扩增温度为94°C，变性5 min，94°C时变性1 min，68°C时变性1 min，72°C时变性1 min，循环35次。再72°C延伸5 min，通过PCR-ELISA鉴定扩增产物。将扩增产物加入包被有结核杆菌包被的生物素标记探针的ELISA波板上，0.1 mL/孔。在37°C温度中孵育1小时后洗板5次，加入有链霉亲和素标记的过氧化物酶。在37°C条件下作用15 min，洗板5次后完全去除上清液。再加入TMB显色液0.1 mL，在37°C条件下反应10 min后加入终止液0.1 mL，通过酶标仪判定反应物在450 nm时的吸光值，记录检测结果。

增菌PCR试验：将0.1 mL处理后的待检标本接种于1 mL血平板培养基，温度为37°C，PH值维持在6.5～7.0，培养4～7天后判定PCR检测结果

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.00统计学软件对数据进行分析，计数资料百分数（%）表示，采用x2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同检测方法的检测结果

罗氏培养、痰涂片试验、PCR技术、增菌PCR检测除观察组痰液标本阳性率分别为23.33%、31.67%、55.00%、66.67%；四种检测方法对对照组痰液标本阳性率均为0；增菌PCR技术对痰液标本阳性检出率＞PCR技术＞罗氏培养＞痰涂片试验，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同检测方法的检测结果（n，%）

2.2 细菌学检查与PCR、增菌PCR检测结果对比

观察组60例患者细菌学检查结果显示涂阳培阳21例，涂阳培阴9例，涂阴培阳26例，涂阴培阴32例；7天增菌PCR检测阳性率与细菌学检查结果，差异无统计学意义（P＞0.05）；7天增菌PCR检测阳性率明显优于PCR，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 细菌学检查与PCR、增菌PCR检测结果比较 [n（%）]

2.3 PCR的特异性、敏感性

将HE7RV结核杆菌标准菌株调制1 mg/mL后进行稀释，分别进行PCR、增菌PCR（4d、7d）。阴性：检测含有TB的DNA；阳性：样品中含有TB基因或表达产物。利用增菌PCR对牛分支杆菌、结核分枝杆菌等多种病原菌培养物检测结果显示，12中非TB检测结果均为阴性，牛分支杆菌、结核分枝杆菌为阳性，说明PCR对结合TB的特异性、敏感性强。

3 讨 论

我国结核病患者人数众多，其具有传染性的特点给患者及社会带来了巨大的挑战。TB是结核病患者的主要致病因，尽早明确患者是否存在TB对疾病的诊治十分重要[3]。主要通过细菌学检查明确患者是否存在TB感染、传染源，细菌学检查是临床诊断结核病的“金标准”，对结核疾病的诊断及治疗方案的选择具有重要作用[4]。实验室检测TB的方法较多，不同检测方法各具特色，寻找特异性强、敏感性强、操作简单、准确检出率高的检测方法是临床检验科医师关注的重点。

痰涂片是细菌学检查的基本方法，操作简单，价格低廉，当天即可获得检测结果[5]。明确痰细菌类型，对痰液中的细菌在不同培养基中进行培养，通过观察生长情况了解细菌种类。同时能进行药敏分析，对合理用药提供指导意见。但是，痰涂片不能分辨活菌、死菌，且细菌数量达到5000～1000条/mL时才能显示阳性，当细菌数量未达到上述标准时就会有假阳性结果，特异性差[6]。且多种抗酸杆菌进行痰涂片时都会着色，难以辨别TB，需要通过进一步试验才能确诊，存在明显的缺陷。细菌学检测对TB敏感性强，但是需要1～2月才能得出检测结果，不适用于急诊检测患者。TB、非TB菌株在细菌学培养时均会生长，需要通过菌种鉴定才能明确是否存在TB，在临床实际运用中存在明显的不足。随着检验医学的不断进步，PCR技术在临床的应用得到了广大医务人员的肯定[7]。PCR具备分子生物诊断技术、核酸扩增技术，是生物学领域的先进检测方法，在结核病的诊断中发挥着明显的优势。具有检测速度快，灵敏度高，特异性强的特点，TB杆菌生长速度慢，通过PCR可以迅速得出诊断结果，为患者的诊治提供准确的诊断依据。

PCR有常规PCR、增菌PCR两种检测方式，本文将PCR两种检测方法与痰涂片、罗氏培养对人体TB检测情况进行对比观察发现，增菌PCR对观察组痰标本阳性检出率为66.67%，PCR对观察组痰标本阳性检出率为55.00%，明显优于痰涂片（31.67%）、罗氏培养（23.33%），由表1可知PCR对TB检出率明显优于罗氏培养、痰涂片，尤其是增菌PCR对TB的阳性检出率明显高于其他方法，而无结核杆菌感染的对照组均未检出阳性标本，无假阳性结果，说明PCR对TB检出率高，特异性强[8]。将PCR、增菌PCR检测结果与细菌学检查结果进行对比观察发现，PCR两种检测方法对涂阳培阳、涂阳培阴、涂阴培阳检出率几乎达到100%，但是PCR对涂阴培阴痰液标本阳性检出率低，仅为18.75%，增菌PCR（4d）检出率为31.25%，增菌PCR（7d）检出率为56.25%，说明增菌PCR检出率明显优于超过PCR。

增菌PCR在对痰液标本进行处理基础上在液体培养基中培养4～7天后再进行特点DNA片段扩增进行TB检测的一种方法，对标本进行预培养使细菌数量增加，加入液体培养基后稀释了扩增抑制物，使细菌高度表达，大大提高了阳性检出率[9]。标本中存在活菌时通过细菌培养后数量会明显增多，标本中不含活菌经过细菌培养后细菌数量不增加，从而保证了阳性检出率的准确性，减少假阳性结果。由表2可知，7天增菌PCR后对涂阴培阳、涂阴培阴阳性检出率明显优于4d增菌PCR、常规PCR，差异有统计学意义（P＜0.05）。增菌PCR的液体培养时间比常规PCR长，但是灵敏度更强[10]。常规PCR在进行痰标本检测时，标本中含有死菌时也会有阳性结果，影响结果的准确性。但是，通过与罗氏培养进行对比发现，增菌PCR的检测时间相对较短，而结核病患者一般病程漫长，结核菌生长速度缓慢，可以作为TB检测的常用方法。

综上所述，在进行TB检测时，PCR技术具有明显的优势，能够明确痰液标本中是否含有TB。而且，增菌PCR技术在PCR基础上进行痰液标本培养，大大提升了对TB的特异性、敏感性阳性检出率高。操作简单，受外因污染少，检测结果准确率高，值得作为实验室检测TB的常用方法。

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[2]唐毓凡.实时荧光PCR方法检测结核杆菌的价值分析[J].右江民族医学院学报,2016,38(2):205-206,210.

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[5]段 静,王 艳,袁 杭,等.结核杆菌五种实验室检测方法比较[J].现代检验医学杂志,2014,29(4):79-82.

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本文编辑：赵小龙

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ISSN.2095-8242.2017.029.5677.02