湿疹1号对脾虚型豚鼠急性湿疹模型免疫功能的影响

王奂云，李忻红，田静，马贤德（．辽宁中医药大学,沈阳003；．辽宁中医药大学附属医院，沈阳003）

湿疹1号对脾虚型豚鼠急性湿疹模型免疫功能的影响

王奂云1，李忻红2，田静1，马贤德1
（1．辽宁中医药大学,沈阳110032；2．辽宁中医药大学附属医院，沈阳110032）

目的 观察湿疹1号对血清噬酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）的作用并分析其对T细胞亚群CD4+、CD8+及其比值的影响，探讨该药治疗急性脾虚湿疹的作用机制。方法 将50只豚鼠随机分成5组，即空白对照组、脾虚急性湿疹空白对照组、脾虚急性湿疹中药治疗低、高剂量组，中药（黄柏胶囊）阳性对照组。采用DNCB涂抹及饮食不节、疲劳过度致脾虚证法建立豚鼠急性脾虚湿疹模型，酶联免疫吸附（ELISA）法与流式细胞术进行血ECP及CD4+T、CD8+T的检测。结果 与空白对照组比较，模型组血清中ECP过度表达，与模型组比较，各给药组ECP表达均明显下降（P＜0．05或P＜0．01），且中药高剂量组疗效要优于低剂量和黄柏胶囊组，而低剂量组与黄柏胶囊组的作用差异无统计学意义（P＞0．05）；与模型组比较，各给药组CD4+T及CD4+T/CD8+T淋巴细胞水平有所升高，而CD8+T水平则有所降低，但仅中药高剂量组差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 湿疹1号能有效抑制皮损中ECP水平的表达，并调节CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞之间的平衡，进而调节人体的免疫功能。

湿疹1号；急性湿疹；噬酸性粒细胞阳离子蛋白；T淋巴细胞

湿疹是一种过敏性炎症性皮肤病，其皮损对称分布，剧烈瘙痒，临床分为急性、亚急性和慢性3类。中医属“湿疮”、“浸淫疮”范畴。中医认为急性湿疮患者多为机体禀赋不足，复感风湿热邪浸淫肌肤所致，临床常见，易诊而难治，近年来发病率有升高趋势[1]。中药湿疹1号具有清热健脾除湿，祛风止痒之功，临床治疗急性湿疹疗效满意。本实验以血清中嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）和T细胞亚群CD4+、CD8+作为研究指标，旨在探讨湿疹1号对脾虚型豚鼠急性湿疹模型的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 健康豚鼠50只，体质量250 g左右，雌雄各半，购自辽宁长生生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2010-0001。实验动物购入后，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物室内，许可证号：SYX K（辽）2013-0009。

1.1.2 药物 湿疹1号（苍术15 g，苦参10 g，荆芥15 g，防风20 g，生地15 g，当归20 g，蝉蜕15 g，泽泻20 g，生石膏25 g，知母15 g，白花蛇舌草20 g，陈皮20 g，车前15 g，赤芍20 g，牡丹皮15 g，白鲜皮20 g，茯苓20 g，甘草10 g）（购自辽宁中医药大学附属医院）传统方法煎煮浓缩，制成煎剂。黄柏胶囊（九惠制药股份有限公司，产品批号：151001，批准文号：国药准字Z44020428）。

1.1.3 试剂与仪器 DNCB（二硝基氯苯），解放军军事医学科学院药材供应站；ECPELISA试剂盒,上海百蕊生物科技有限公司，批号：201409。不同荧光素标记的抗CD4、CD8单克隆抗体（BD,Biosciences公司）；anthos2010型酶标仪（奥地利安图公司）；流式细胞仪（型号FACSCalibur，美国BD公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模 建立急性湿疹模型[2]，除空白对照组外，其余组豚鼠在实验前1 d颈部去毛，面积约3 cm× 3 cm，实验当天用5%二硝基氯苯（DN CB）丙酮溶液25μL外涂于去毛处致敏，1周后在豚鼠右耳内侧涂1%DNCB丙酮溶液100μL作为激发，之后每隔3 d激发1次，连续5次，观察豚鼠右耳较左耳明显红肿，并出现渗出、结痂，即表明造模成功。

建立豚鼠脾虚模型,每只豚鼠单日喂甘蓝10～15 g，自由饮水，每2 d以猪油3mL/只灌胃，在上述处理后当日放入27℃水池中，游泳至耐力极限，即豚鼠无力游动，经驱赶仍不能继续，且身体向腹侧蜷曲、发抖甚至下沉等征象，1次/d，连续8 d。观察造模组豚鼠，若出现倦怠、嗜卧、懒动、眯眼、扎堆、便条状稀便、毛发散乱无光泽、体温略有降低、体质量下降及食量减少等症状，5个以上即可认为脾虚模型复制成功[3]。

1.2.2 分组及给药 将50只豚鼠随机分成5组，即空白对照组、脾虚急性湿疹空白对照组、脾虚急性湿疹1号低剂量组、脾虚急性湿疹1号高剂量

组，脾虚急性湿疹中药（黄柏胶囊）阳性对照组，10 只/组。末次激发1 d后给药，根据人与豚鼠体表面积比例进行换算，黄柏胶囊组用量232．5mg；中药高低剂量组：3．875mL/只灌胃，（分别含原药材15．5 g，3．875 g）其余组予等量生理盐水灌胃。1次/d，连续用药14 d。

1.2.3 实验指标及检测技术

1.2.3.1 血清中ECP含量检测 2周后，豚鼠模型未处死前，腹主动脉采血，离心后取血清。采用酶联免疫吸附法（ELISA）对各组豚鼠血清中ECP含量进行检测，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3.2 采用流式细胞术检测CD4+T、CD8+T 末次给药后2 h，经心脏穿刺采集豚鼠全血2mL，并抗凝。另取1支试管，其中加入2mL淋巴细胞分离液，并将试管倾斜30°～45°，然后用玻璃吸管吸取抗凝血，缓慢加至淋巴细胞分离液之上，切勿令淋巴细胞分离液与抗凝血混合。将试管置于离心机中，1 200转/min，离心10min。取出试管，观察血细胞分离情况，在淋巴细胞分离液与血浆层之间的毛玻璃状细胞层即为淋巴细胞层，吸取淋巴细胞层至另一离心管中，以PBS缓冲液洗涤3次，末次洗涤调整细胞浓度至1×105个/mL，并吸取0．5mL细胞悬液用于流式细胞检测T淋巴细胞亚群。于细胞悬液中加入CD4/CD8双标流式抗体5μL，混匀后，避光，37℃孵育30min，以PBS洗涤细胞2次，上机检测。流式细胞仪操作过程由辽宁中医药大学附属医院检验科代为完成。

1.3 统计学分析 采用SPSS16．0软件进行统计学分析，以±s表示计量资料,组间数据用单因素方差分析法进行比较,两两比较采用LSD法，P＜0．05时具有统计学意义。

2 结果

2.1 湿疹1号对豚鼠血清中噬酸细胞阳离子蛋白（ECP）的影响 与空白对照组比较，脾虚急性空白对照组血清中ECP均有升高（均P＜0．01），表明造模成功。与模型组比较，中药高、低剂量组与黄柏胶囊组外周血清中ECP均明显降低（P＜0．05或P＜0．01）且中药高剂量组疗效要优于低剂量和黄柏胶囊组，而低剂量组与黄柏胶囊组的作用差异无统计学意义（P＞0．05），见表1。

2.2 湿疹1号对T细胞亚群CD4+、CD8+及其比值的影响 CD4+T淋巴细胞水平可见模型组较空白对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0．01），治疗各组与模型组之间比较有升高趋势，但仅高剂量组差异有统计学意义（P＜0．05）；CD8+T淋巴细胞水平则模型组较空白对照组升高，差异有统计学意义（P＜0．01），而治疗各组相对模型组均有降低趋势,但仅高剂量组差异有统计学意义（P＜0．05）；CD4/CD8可见模型组较正常组显著降低（P＜0．01），其他各组较模型组有升高趋势，但仅高剂量组差异有统计学意义（P＜0．05），见表2。

表1 湿疹1号对豚鼠血清中ECP的影响 （±s）

表1 湿疹1号对豚鼠血清中ECP的影响 （±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0．01；与脾虚急性空白对照组比较△P＜0．05，△△P＜0．01；与湿疹1号低剂量组比较▲P＜0．05。

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表2 湿疹1号对T细胞亚群、及其比值的影响 （±s）

表2 湿疹1号对T细胞亚群、及其比值的影响 （±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0．01；与脾虚急性空白对照组比较△P＜0．05。

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3 讨论

湿疹是由内外因素共同引起的一种渗出倾向的炎症性皮肤病，内因包括慢性感染病灶、血液循环障碍、神经精神因素等，外因包括食物、生活环境以及各种化妆品等。其发病机制与免疫功能密切相关，可伴有肥大细胞，细胞因子（CK），嗜酸性粒细胞（EOS）的参与，众所周知，E OS可分泌大量神经毒素成分,主要包括碱性蛋白（MBP）、嗜酸性粒细胞过氧化物酶素（EPO）、ECP等，其中ECP是细胞毒性最强的强碱性颗粒蛋白，可诱导肥大细胞释放组胺，而皮肤血管内有H1、H2两种受体,组胺通过两种受体共同作用可引起毛细血管扩张和血管壁通透性增强从而增加炎症渗出，进而导致皮肤湿疹样变。组胺在基膜或表皮中会引发痒感,而被释放到真皮后则引起疼痛和血管性水肿,其痒感通常伴有潮红和风团。本实验湿疹模型中ECP水平含量较高与赵俊芳等[4]的研究一致。故ECP可作为EOS的活化标志，可作为检测变态反应炎症程度的标准[5]。目前湿疹治疗方法多样化，常采用口服抗组胺药和外用激素软膏等方法，但缓解期短且易复发，而中医通过辨证论治，自拟湿疹1号方取得了良好疗效，不良反应较少，提高了患者的生活质量。由表1可知，豚鼠湿疹模型组中血清ECP表达明显高于空白对照组，各治疗组ECP水平明显降低，且湿疹1号高剂量组疗效最佳，说明湿疹1号可能是通过抑制血清中ECP的表达从而达到治疗目的。

湿疹的发病可能与Ⅰ型和Ⅳ型变态反应有关[2]，在Ⅳ型变态反应中T淋巴细胞起着至关重要的作用。本组资料显示，用药后CD4+及CD4+/CD8+T淋巴细胞水平升高，同时CD8+T淋巴细胞水平降低，由此湿疹1号的作用机制可能是对豚鼠T淋巴细胞亚群水平有良好的双向调节作用，使低者升高，高者降低，纠正豚鼠机体免疫功能失衡状态，从而减少炎症渗出。CD4+T淋巴细胞是辅助性淋巴细胞(Th)，主要功能是协助单核-巨嗜细胞及B淋巴细胞发挥免疫功能，CD8+T淋巴细胞为抑制性淋巴细胞(Ts)，可特异性杀伤靶细胞，因而机体内CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及其比值的大小可作为衡量细胞免疫状态的指标，其比值上升，提示免疫应答的正向调节优势，反之提示免疫功能低下[6]。本实验结果表明，湿疹1号有调节T淋巴细胞亚群的作用，尽管湿疹1号低剂量组、黄柏胶囊组与模型组比较差异无统计学意义,但高剂量组较模型组差异有统计学意义（P＜0．05），说明湿疹1号在一定剂量或疗程下可能降低CD8+T淋巴细胞及升高CD4+/ CD8+来调节T淋巴细胞亚群的平衡,从而调节细胞免疫功能紊乱,减轻炎症损伤。

[1]崔文强,徐飞,王明燕,等．急性湿疹血浆CGRP的改变及皮炎平干预作用的研究[J]．光明中医,2014,29（6）:1170-1173．

[2] 李丽,甄莉．黄芪对湿疹大鼠皮损中白细胞介素-4和干扰素-γ影响的实验研究[J]．中国药物与临床,2010,10（1）:53-54．

[3] 田静,李忻红,朱卉雯,等．健脾养血祛风方对脾虚慢性湿疹模型小鼠皮肤组织水通道蛋白3的影响[J]．中国中医药信息杂志, 2015,22（7）:47-50．

[4] 赵俊芳,王学谦,李桂珍,等．双抗体夹心ELISA法检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白[J]．临床检验杂志,2011,29（5）:336-338．

[5] 雍磊,程相铎,李波,等．变应性皮肤病患者血清IgE和ECP分析[J]．中国麻风皮肤病杂志,2005,21（11）:881-882．

[6] 李春光,王月飞,赵红晔,等．化湿汤结合润肤止痒膏对湿疹小鼠细胞免疫功能的影响[J]．中国药物警戒2015,12（3）:137-139,143．

Effectsof Shizhen Yihao on Immune Function of Spleen-deficiency Type ofGuinea Pig M odelsw ith Acute Eczema

Wang Huanyun1，LiXinhong2，Tian Jing1，Ma Xiande1
1.Liaoning University of TraditionalChinese Medicine,Shenyang 110032,China；2.Affiliated Hospitalof Liaoning University of TraditionalChineseMedicine,Shenyang 110032,China

Objective In order toobserve theeffectsofShizhen Yihaoon serummacrophage cationic protein（ECP）and than analyze its influence on the CD4+,CD8+and the ratio of T cells,and to explore themechanism of the drug in the treatmentof acute eczema of spleen-deficiency．Methods Fifty guinea pigswere randomly divided into 5 groups,namely blank control group,acute eczemaofspleen deficiency in the blank controlgroup,acute eczema ofspleen-deficiency of traditionalChinese medicine in the treatmentof low and high-dosegroup,traditionalChinesemedicine（Huangbaicapsu le）positive controlgroup．Using DNCB smear and diet,fatigue excessive spleen deficiencymethod to establish the guinea pigmodelsofacute spleendeficiency,enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）and flow cytometry for blood ECPand TCD4+,TCD8+detection．Results Compared with the blank control group,the serum ECP in model group was over expressed．Compared with the model group,the expression of ECP in each group was significantly decreased（P＜0．05 or P＜0．01）．Effectof the high dose Chinese traditionalmedicine group was better than that of low dose and Huangbai capsule group,and low dose group and Huangbaicapsule group showed no significantdifference（P＞0．05）．Compared with themodelgroup,the drug group,CD4+T and CD4+/CD8+T lymphocytes increased,and the level of CD8+T decreased,butonly high dose of Chinesemedicine group had significant differenc e （P＜0．05）．Conclusion Shizhen Yihao can effectively inhibit the expression of ECP in skin lesions,and regulate the balance between TCD4+lymphocytesand TCD8+lymphocytes,and regulate the immune function of the body．

Shizhen Yihao；Acute eczema；Eosinophil cationic protein；T lymphocytes

R758．23

：A

：1672-0709（2017）03-0224-03

2016-05-22）

辽宁省教育厅高等学校科学研究项目（编号：L2012342）；辽宁省中医药学（专）科能力建设项目（编号：2011-lnzyxzk-03）

李忻红，E-mail：13644067465@163．com