大翅蓟属植物提取物对皮肤屏障功能损伤的修复作用探讨

陈俊杰，唐翠，严明强，沈玲华（.复旦大学生命科学学院，上海004；.上海浦恩生化科技有限公司，上海0006；.嘉法狮（上海）贸易有限公司，上海00）

·论著·

大翅蓟属植物提取物对皮肤屏障功能损伤的修复作用探讨

陈俊杰1，唐翠1，严明强2，沈玲华3
（1.复旦大学生命科学学院，上海200433；2.上海浦恩生化科技有限公司，上海200063；3.嘉法狮（上海）贸易有限公司，上海201203）

目的 观察大翅蓟属植物提取物对皮肤屏障相关蛋白的表达的影响，探讨其屏障修复作用。方法 通过使用胶带黏贴的方法，对离体培养的皮肤造成皮肤屏障功能损伤模型，每隔2 d涂抹大翅蓟属植物提取物，7 d后评估损伤皮肤的淋巴上皮Kazal型相关抑制因子（Lympho-epithelial Kazal type related inhibitor，LEKTI），兜甲蛋白（Loricrin，LOR），内披蛋白（Involucrin，INV）丝聚合蛋白（Filaggrin，FLG）的表达情况。结果 正常皮肤和受损皮肤的LEKTI，LOR，INV，FLG染色均有增强，受损皮肤增强更为明显。结论 大翅蓟属植物提取物可以提高皮肤FLG、LOR、INV、LEKTI的表达，进而提高皮肤屏障功能。

皮肤屏障；中间丝聚合蛋白；兜甲蛋白；外皮蛋白；淋巴上皮Kazal型相关抑制因子

大翅蓟属植物富含黄酮类化合物、倍半萜烯及其内酯和甾醇类化合物等具有生物活性的成分，具有抗肿瘤、抗菌、调节心肺功能、愈创等药理活性。皮肤屏障功能主要位于表皮，表皮分化过程中涉及的相关蛋白：中间丝聚合蛋白（Filaggrin，FLG）、兜甲蛋白（Loricrin，LOR）及外皮蛋白（Involucrin，INV），淋巴上皮Kazal型相关抑制因子（Lympho-epithelial Kazal type related inhibitor，LEKTI），对于维持皮肤的屏障功能都具有重要的作用，是皮肤屏障功能的重要标志物[1-3]。皮肤屏障功能缺陷与多种皮肤疾病有关。胶带黏贴是皮肤科常用的研究方法，也是目前公认的建立皮肤屏障损伤模型简单有效的方法[4]。本试验通过测定大翅蓟属植物提取物（以下简称提取物）对人受损皮肤中相关蛋白FLG、LOR、 INV及LEKTI表达的影晌，探讨其对表皮屏障功能的修复作用，从而为临床上治疗皮肤屏障功能相关疾病提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 anti-LEKTI单克隆抗体（clone 1C11G6,ref:sc-32330）购自SantaCruz；anti-Involucrin单克隆抗体（clone SY5,ref:sc-21748）购自Santa Cruz；anti-Loricrin多克隆抗体（ref:PRB-145）购自Covance；anti-filaggrin单克隆抗体（cloneOKTB1,ref: BT 576）购自BTI；VIP显色试剂盒购自VECTOR laboratories。

1.2 方法

1.2.1 外植体准备 皮肤来源于48岁的做腹部整形术的白人女性，9例外植体做胶带黏贴处理，另外9例外植体是正常皮肤。所有外植体保存于有机外植体介质（BEM）中。保存条件为37℃，潮湿，5% CO2。培养液每天更新。具体分组见表1。

表1 试验分组表

1.2.2 角质层损伤 用胶带（3M，550）连续黏贴10次。

1.2.3 配方应用 每2 d（D0，D2，D4，D6）在外植体上涂抹2mg配方。

1.2.4 组织学取样 D0，所有外植体取样并分割为二，一半-80℃冷冻，另一半甲醛固定。D7，各批次样品经过同样的方法取样处理。

1.2.5 组织学 经甲醛固定的样本24 h后，用石蜡浸润脱水，包埋，嵌入，切片，与急速冷冻的硅烷化载玻片结合。

冷冻的样本经切片后，与硅烷化载玻片结合。使用显微照相系统照相存储。

1.2.6 荧光免疫 LEKTI免疫染色：石蜡包埋样本，使用anti-LEKTI单克隆抗体免疫染色LEKTI，生物素/链霉亲和素加强信号，异硫氰酸荧光素（FITC）显示。原子核由碘化丙啶复染。

Involucrin免疫染色：石蜡包埋样本，使用anti-Involucrin单克隆抗体免疫染色Involucrin，生物素/链霉亲和素加强信号，VIP显色试剂盒显示。原子核由Masson复染。

Loricrin免疫染色：冰冻组织样本，使用anti-Loricrin多克隆抗体免疫染色Loricrin，生物素/链霉亲和素加强信号，异硫氰酸荧光素（FITC）显示。原子核由碘化丙啶复染。

FLG免疫染色：冰冻组织样本，使用antifilaggrin单克隆抗体免疫染色filaggrin，生物素/链霉亲和素加强信号，异硫氰酸荧光素（FITC）显示。原子核由碘化丙啶复染。

2 结果

2.1 LEKTI 7 d后，LEKTI染色结果显示，正常皮肤阴性对照组和阳性对照组无明显变化，提取物组荧光染色增强；受损皮肤阴性对照组和阳性对照组轻微减弱，提取物组荧光增强明显。见图1。

2.2 LOR 7 d后，正常皮肤和受损皮肤LOR染色结果显示，阴性对照组和阳性对照组无明显变化，受损皮肤提取物组染色明显增强。见图2。

2.3 FLG 7 d后，正常皮肤和受损皮肤FLG染色结果显示，阴性对照组无明显变化，阳性对照组和提取物组荧光均明显增加。见图3。

2.4 INV 7 d后，正常皮肤和受损皮肤INV染色结果显示，阴性对照组无明显变化，阳性对照组和提取物组染色均明显增加。见图4。

3 讨论

大翅蓟主产于新疆乌鲁术齐、古尔班通古特沙漠（玛纳斯）、伊犁谷地（伊宁）、准噶尔阿拉套地区（塔城等），生于山坡、荒地或水沟边。在土耳其、伊朗等国，大翅蓟有悠久的药用历史。在新疆当地，维吾尔族医生用大翅蓟果实来治疗皮肤病。中医认为大翅蓟“酸凉，入肝经，凉血止血”，“内服，煎汤，3～ 9 g”，“全草供药用，有止血之功效”[5-6]。大翅蓟属植物的化学成分和药理活性研究报道始见于上世纪60年代，近40年来国外学者对该属植物的化学成分、药理活性进行了大量的研究。2000年，伊朗学者Koochek等[7]研究发现大翅蓟的不同药用部位的醇提物对手术造模形成的创伤有愈创作用，其中花的70%乙醇提取物促进伤口愈合的功效最强。

图1 LEKTI（免疫荧光染色×400）

图2 LOR（免疫荧光染色×400）

图3 FLG（免疫荧光染色×400）

图4 INV（免疫组化染色×400）

皮肤屏障功能主要位于角质层。砖墙模型是现在公认的表皮角质层屏障结构模型。其主要包括角质细胞及其角化包膜（砖）和细胞间的脂质双分子层（泥）。兜甲蛋白、内披蛋白、丝聚合蛋白等相互交联形成角化包膜，角质细胞镶嵌在其中构成了皮肤的物理屏障结构。

FLG是表皮角质层内的一种亲水性蛋白，其前体是丝聚蛋白原（Profilaggrin），主要存在于颗粒层。当角质形成细胞从颗粒层向角质层分化时，颗粒层的丝聚蛋白原迅速去磷酸化成为可溶性的FLG。单体的FLG与角蛋白丝结合，使其变得更为致密，同时随着角质细胞成熟脱水，FLG分解生成大量的天然保湿因子，这对保持皮肤的水合作用和皮肤屏障至关重要[8]。Filaggrin还可以调节角质细胞增殖，增加其对细胞凋亡信号的易感性[9]，因此Filaggrin在表皮细胞分化中也起着重要作用，是KC终末分化的重要标志之一。它的异常表达可以削弱皮肤屏障功能，导致多种皮肤病的发生。

LOR、INV是2种重要的终末分化蛋白，两者皆参与角质化套膜的组成，在维持皮肤屏障功能中发挥着重要作用。LOR是角质形成细胞终末分化的一种疏水性蛋白，开始表达在颗粒层，占角化套膜蛋白量的80%，是角化细胞套膜的主要加固蛋白[10]。INV是角质化套膜的另一重要组份，位于角质化套膜的外层，形成角质化套膜的基本骨架，与含有-OH的神经酰胺共价结合，由此将脂质基质和角化细胞致密地连接起来，共同形成皮肤的屏障结构[11]。

LEKTI是一种新型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，广泛存在于皮肤及黏膜、扁桃体、胸腺等器官。在表皮中，LEKTI主要在棘层上部及颗粒层表达[12]。它可以抑制丝氨酸蛋白酶对角质层桥粒蛋白的降解作用，提高角质层细胞间的黏合力，从而起到保护皮肤屏障的作用[13]。

笔者的体外研究表明，大翅蓟属植物提取物可以提高FLG、LOR、INV、LEKTI的表达，从而提高表皮屏障的“砖墙”结构的稳定性，增强“砖墙”结合力，进而提高皮肤屏障功能。但这其中的具体机制还不清楚，尚有待进一步研究。

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（收稿:2016-09-03）

·消息·

Repair EffectofOnopordon Extracton the Damaged Skin Barrier Function

Chen Junjie1,Tang Cui1,Yan Mingqiang2,Shen Linghua3
1.School of Life Sciences Fudan University,Shanghai200433,China;2.Shanghai Puen Biotech Co.Ltd.,Shanghai200063, China;3.GattefosseChina Trading Co.Ltd.,Shanghai201203,China

Objective In order to study the expression of four skin barrier related proteins induced by the onopordon extract and explore its repairment.Methods The extractwasapplied topically every two daysatD0,D2,D4 and D6 on the normal and damaged skin which was performed by tape stripping in vitro,the expression of lympho-epithelial Kazal type related inhibitor(LEKTI),loricrin(LOR),involucrin(INV),and filaggrin(FLG)were investigated by immunohistochemistry after 7 days.Results The staining intensity of four proteins increased in normal and damaged skin,especially the damaged skin. Conclusion Onopordon extract can improve the expression of FLG,LOR,INV,LEKTI,and improve the skin barrier function.

Skin barrier;Filaggrin;Loricrin;Involucrin;Lympho-epithelialKazal type related inhibitor

R758.1

：A

：1672－0709（2017）03-0193－04