无创DNA检测临床应用的研究进展

王宏吉，曾晓玲，赵淑云

（1.贵州医科大学2015级研究生，贵州 贵阳 550001；2.贵州医科大学附属医院妇产科，贵州 贵阳 550001）

出生缺陷是指胎儿出生前已经存在的结构或功能异常，是导致早期流产、死胎和先天残疾的主要原因，不仅影响婴幼儿生活质量及健康，且对家庭和社会带来沉重的负担，因此重视产前诊断对降低新生儿缺陷发生率尤为重要。

1 无创DNA检测发展进程

常规的产前诊断技术需要通过侵入性穿刺，存在0.5%～3%左右的流产风险，如绒毛穿刺（1%～3%流产率）、羊膜腔穿刺（0.5%～1%流产率 ）及脐静脉穿刺（0.5%～1%流产率）等。

无创DNA检测（Non-invasive Prenatal Testing，NIPT）是通过提取母体外周血血浆中胎儿游离DNA进行检测，分析胎儿是否患遗传性疾病的一种检测方法。1997年[1]Lo等用常规聚合酶链反应(PCR)，在男胎孕妇血浆检测到Y染色体特异性DNA序列，证实孕妇血浆中存在胎儿DNA可能，相比侵入性产前诊断，其更便捷、无流产风险。检测方法包括荧光染色体原位杂交、荧光定量聚合酶链反应、二代测序法等。近年发现表观遗传领域中基于胎儿-母体DNA不同的甲基化区域可提取胎儿DNA，通过寻找常见染色体差异甲基化片段，以父系遗传的多态位点代替SRY基因，打破男性胎儿的限制，能检验胎儿性别鉴定、血型鉴定，定性分析胎儿DNA的存在，提高异常染色体检出率，对自发流产、早产等都有一定的预测意义[2]，但临床运营成本较大，仍需大量临床实践考证。

1.1 染色体非整倍体疾病

胎儿染色体非整倍体疾病可致严重的新生儿出生缺陷和儿童期死亡，这类疾病常见的染色体异常主要是21一三体、18一三体、13一三体。Gil等[3]在PubMed、EMBASE和Cochrane图书馆运用meta分析了从2011年1月和2015年1月4日之间关于无创DNA检测的文章，通过计算无创DNA检测21/18/13-三体、性染色体三倍体阳性检出率，发现在单胎妊娠中三体总阳性检出率和假阳性率分别为99.2%和0.09%。21-三体阳性检出率及假阳性率为96.3%和0.13%，18-三体为91.0%和0.13%，13-三体为90.3%和0.23%，性染色体三倍体为93.0%和 0.14%。双胎妊娠对于21-三体阳性检出率和假阳性率分别为93.7%和0.23%。综上无创DNA检测对21-三体检出率高于其他染色体非整倍体检出率，单胎21-三体检出率稍高于双胎，且假阳性率低于双胎假阳性率。

关于无创DNA检测出现假阴性、假阳性[4]，其可能原因是异常细胞可能分布在胎盘滋养层、胚外中胚层并不一定来自于胎儿，如果胎盘细胞正常胎儿细胞异常，则可能导致结果假阴性，反之可致假阳性。

1.2 微缺失微重复综合征（MD）

染色体微缺失微重复综合征是由于染色体微小片段缺失或重复，使正常基因发生改变而导致的染色体病，该类疾病目前已发现近300种，发病率在1/200000～1/4000不等[5]。

近年来国内Hu等[6]通过对1190例选择无创DNA微缺失微重复综合征检测的孕妇进行跟踪发现，NIPT可以筛查较大片段的缺失和重复，但对较小的缺失或重复检出能力欠佳，猜测原因可能是母体背景干扰结果，建议检测阳性的病例接受有创性产前诊断取样进行验证。

美国妇产科学会和母胎医学会不支持无创DNA检测常规用于MD筛查[7]，由于其缺乏对每一种微缺失微重复综合征对于其临床验证、敏感性和特异性的准确信息，所以难以对其临床预测价值进行准确估计。国际产前诊断协会建议[8]，无创DNA检测应局限于临床意义重大的疾病或明确定义的严重病症，对一些临床意义不明确的MD，对结果判读和临床处理时面临较大的风险。但Lorraine Dugoff等[9]认为对于MD筛查，无创DNA检测可作为一种额外的辅助筛查。对于孕早、中期B超发现胎儿异常的患者，首先应建议早期绒毛活检或羊膜穿刺术，使用染色体微阵列分析，但对于不考虑侵入性产前诊断的孕妇，无创DNA检测也是一种选择，但应该让患者知晓该检测提供的是筛查而不是诊断，必要时分娩后进一步诊断。

1.3 单基因病检测

单基因遗传病是由单一位点的等位基因异常导致的疾病。目前人类孟德尔遗传网（Online Mendelian Inheritance In Man，OMIM) 列出了3173种已知分子基础的疾病。当孕妇有单基因病家族史、B超提示异常胎儿改变时，羊膜穿刺术或早期绒毛膜活检（CVS）可以用于诊断，但Ana等[10]认为CVS更有利于胎儿DNA提取，但同时胎儿的流产风险增加，部分有心理负担的孕妇更愿意选择无创DNA检测。

现无创DNA检测可检测的单基因疾病有：肌强制性营养不良、亨廷顿氏舞蹈症、软骨发育不全、早期原发性肌张力障碍、X性连锁遗传、血友病、囊肿性纤维化、α地中海贫血、β地中海贫血、丙酸血症、先天性肾上腺皮质增生症、血红蛋白Lepore病、莫克—格伯综合征、颅缝早闭症[11]。对于常染色体显性遗传病的诊断基于胎儿DNA中来自父亲等位基因所致的基因改变，部分单基因疾病由于女胎缺乏特异性基因序列识别，故女胎在单基因病诊断中存在局限性。

此外，无创DNA技术也渐渐扩展到肿瘤领域。最早在1977年Leon 等[12]采用放射免疫法测定不同类型癌症患者和健康人血清游离DNA水平，发现测试血浆中游离DNA可评估癌症预后及放化疗方案选择。2016年Bedin[13]顺利提取结肠癌患者血浆游离DNA通过定量甲基化特异性PCR检测SFRP1抑制基因启动子区，对癌症晚期手术预后及随访复查有重要意义。

2 未来展望

随着分子生物学发展，无创DNA检测通过检测胎儿游离核酸，即cffDNA等潜力生物预测标记物，可以有效地预测部分遗传疾病实现优生优育，具备较高准确性、敏感性，虽不能作为诊断手段，但对“珍贵儿、前置胎盘、心理负担过重”等孕妇仍然是一种选择。作为近年来炙手可热的研究项目，不仅在产前诊断领域拥有发展潜力，在其他学科领域也拥有一定临床价值，在不久的将来仍有巨大发展空间。

[1]Lo YM,Corbetta N,Chamberlain PF,et a1.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum [J].Lancet,1997,50 (9076):485-487.

[2]Papageorgiou, E.A.,Karagrigoriou, A., Tsaliki,E.,Velissariou,V.,C arter,N.P.,Patsalis,P.C.,2011. Fetal-speci fi c DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21.Nat. Med.17(4):510-513.

[3]M.M.Gil,M.S.Quezada,R. Revello,R.Akolekar,K.H.Nicolaides,Analysis of cell-free DNA in maternal blood inscreening for fetal aneuploidies:updated metaanalysis,Ultrasound in Obstertrics & GynecologyMarch[J].2015:241-362.

[4]Van Opstal D,Srebniak MI1 Polak J,False Negative NIPTResults:Risk Figures for Chromosomes 13,18 and 21 Based on Chorionic VilliResultsin 5967 Cases and Literature Review.PLoS One.2016 Jan 15;11(1):e0146794.

[5]Weise A,Mrasek K,Klein E, Mulatinho MV,Llerena JC Jr,Hardekopf D, Pekova S,Bhatt S,Kosyakova N and Liehr T(2012)Microdeletion and Microduplication Syndromes.J Histochem Cytochem 60:346-358.

[6]胡芷洋,郭 辉.无创产前检测筛查胎儿微缺失微重复综合征阳性病例的临床分析[J].中国产前诊断杂志(电子版),2016,8(1):14-18.

[7]Cell-free DNA screening for fetal aneuploidy. Committee Opinion No.640.American College of Obstetricians and Gynecologists.Obstet Gynecol,2015,126:31-37.

[8]Benn P,Borrell A,Chiu RWK,et al. Position statement from the chromosome abnormality screening committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis.Prenat Diagn,2015,35:725-734.

[9]Dugoff,L, Mennuti,M.T.,and McDonald-McGinn,D. M. (2017) The bene fi ts and limitations of cell-free DNA screening for 22q11.2 deletion syndrome.Prenat Diagn,37:53-60.

[10]Ana Bustamante-Aragonés,Non-invasive prenatal diagnosis of singlegene disorders from maternal blood,Gene, 2012(8):144-149.

[11]韩璐好,陈晓丹,蒋玮莹.无创产前检测的发展过程[J].中国优生与遗传杂志,2016,24 (7):4-5.

[12]Leon S A,Shapiro B,Sklaroff D M,Yaros M J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy[J].Cancer Res, 1977,37:646-650.[13]Bedin C,Enzo MV, Del Bianco P.Diagnostic and prognostic role of cellfree DNA testing for colorectal cancer patients.Int J Cancer. 2016 Dec 10.