固定酶底物法测定水中粪大肠菌群的优点及影响因素

杨晓冉，朱 超，张付海，胡雅琴，张 敏

(安徽省环境监测中心站,安徽 合肥 230061)



固定酶底物法测定水中粪大肠菌群的优点及影响因素

杨晓冉，朱 超，张付海，胡雅琴，张 敏

(安徽省环境监测中心站,安徽 合肥 230061)

使用酶底物法和多管发酵法检测水质中的粪大肠菌群，结果表明，两种方法在统计学上并无显著差异。酶底物法具有操作快速简便的优点，检测灵敏度也高于多管发酵法。酶底物法可以采用成品的培养基及试剂，操作方便，无需确认试验，20 h即可判断水样中粪大肠菌群的MPN值，实验环境是否无菌对酶底物法测定水中粪大肠菌群的影响不大，但是培养温度对结果影响较大。

粪大肠菌群；环境监测；酶底物法；多管发酵法；快速检测；影响因素

粪大肠菌群(Fecal coliform)主要来自粪便，它在44～44.5℃的高温条件下仍可生长繁殖并发酵乳糖产酸产气，其他特性均与总大肠菌群(Total coliform)相同。因此，可用提高培养温度的方法造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。

目前水中粪大肠杆菌群(耐热大肠菌群)的检测方法主要有传统的多管发酵法和滤膜法，并且已经列入环保行业标准方法，此两种传统方法被国内环境检测部门广泛采用。传统方法实验操做需要较多的试剂和器材，步骤繁琐，检测周期较长，培养基保存时间短，阳性结果需验证试验，对实验环境的无菌程度要求也比较高，不能对水的卫生学状况做出快速评价，制约了其应用。

固定底物酶底物法利用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶(β-D galactosidase)分解ONPG(Ortho-nitrophenyl -β-D galactopyranoside)使培养液呈黄色，来判断水样中是否含有大肠菌群、粪大肠菌群(耐热大肠菌群)。目前被美国、欧洲及大部分亚洲国家广泛应用于水中总大肠杆菌、粪大肠菌群(耐热大肠菌群)及大肠埃希氏菌的检测，并通过美国EPA、《水与废水标准检测方法》以及我国《生活饮用水标准检验方法》认证。

本文通过比对试验，证实了酶底物法和多管发酵法在统计学结果上无显著差异，并对影响酶底物法的实验条件进行了研究。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

乳糖蛋白胨和EC肉汤培养基；高温压力灭菌器；3 mm 接种环；科立得TM(Colilert R)试剂(美国爱德士生物科技股份有限公司)；标准菌株 IDEXX-QC(大肠埃希氏菌，MPN值/100 mL标准值341/100 mL，可接受范围34～703/100 mL)无菌取样瓶(里面装有1.5%硫代硫酸钠去除水样中的余氯)；97孔定量盘；封口机(带97孔定量盘橡胶托垫)；97孔阳性标准比色盘；培养箱。

1.2 样品来源

巢湖入湖口水源水，某污水处理厂出水，某固废处理厂出水。

1.3 实验方法

1.3.1 多管发酵法

参考《GB/T5750.12-2006生活饮用水标准检验方法》和《HJ/T 347-2007水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法(试行)》，具体操作步骤详见表1。

1.3.2 酶底物法

具体操作方法详见表1。

2 结果

2.1 实验数据的可行度评价

采用粪大肠菌群质控样品IDEXX-QC(大肠埃希氏菌，批号：012116)，来自国家标准菌库(NCTC)9001(批号111815)，用无菌水稀释到一定的倍数，分别用酶底物法和多管发酵法培养，查MPN表得出结果。如表2所示，两种方法的测定结果均在质控范围内。经配对t检验分析，两者差异无统计学意义，t=0.63，P>0.05。

2.2 两种方法的比对分析

采用多管发酵法和酶底物法同时测定巢湖入湖口。

表1 多管发酵法、酶底物法测定水中粪大肠菌群方法的比较

水样共计36个(样品编号1-36)，某污水处理厂出口水样(生活废水)共计8个(样品编号37-44)，某固废处理中心出口水样共计8个(样品编号45-52)，总计52个。分析结果如图1所示。线性回归分析见图2。线性回归方程为y=0.9974x+0.6025，r2=0.81。两种方法的测定数据在指数水平上具有较好的一致性。

2.3 实验环境对酶底物法分析结果的影响

在同一个点位采样8份，用酶底物法分别在无菌操作间、非无菌实验室、室外环境中进行检测，分析结果如图3所示。将非无菌室和室外检测的结果分别与无菌室中检测的结果进行配对t检验分析，t值分别为0.57和0.91，P>0.05。因此，酶底物法与实验环境是否无菌关系不大。

2.4 培养温度对酶底物法分析结果的影响

在8个不同的点位采集水样，用酶底物法在40～49℃进行培养，结果如表3。将44℃和45℃两组培养结果进行配对P检验，t=1.39，P>0.05，两组数据无显著性差异。但是40℃、42℃、47℃和49℃的培养结果与44℃相比，均有显著性差异(P<0.05)。

粪大肠菌群的最佳培养温度为44.5±0.5℃。如果培养温度过低，除了粪大肠菌群之外的其他大肠菌群会有部分继续生长，从而导致结果偏高。而培养温度过高，粪大肠菌群会停止生长，导致结果偏低。因此，酶底物法分析粪大肠菌群需严格控制培养温度。

表2 质控样品的分析结果

2.5 培养时间对酶底物法分析结果的影响

在8个不同的点位采集水样，在44.5±0.5℃的温度下培养，定时观察培养结果。12 h以内培养物的显色不明显，不易判断阳性结果，约20 h培养物阳性数量和颜色会达到稳定。延长培养时间至36 h，阳性数量基本不变化。如图4所示，酶底物法测定水中粪大肠菌群， 20 h左右即可判断阳性结果。

3 结论

酶底物法和多管发酵法检测水中粪大肠菌群的结果一致性方面无显著性差异，且酶底物法的检测灵敏度高于多管发酵法。酶底物法可以采用成品的培养基及试剂，操作方便，无需确认试验，20 h即可判断水样中粪大肠菌群的MPN值，实验环境是否无菌对酶底物法测定水中粪大肠菌群的影响不大，但是培养温度对结果影响较大。因此，酶底物法较好地弥补了传统方法的不足，可以替代多管发酵法在常规监测和应急污染事故中做出快速评价。

表3 不同培养温度下的分析结果

[1]本书编委会.水和废水监测分析方法(第四版)[M]. 北京:中国环境科学出版社, 2002.

[2]水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法(试行):HJ/T 347-2007[S].

[3]生活饮用水标准检验方法微生物指标:GB/T 5750. 12-2006[S]. 北京:中国标准出版社,2006.

[4]汤琳，李备军，龚海燕，张锦平.粪大肠菌群酶底物法在环境应急监测中的应用[J].环境监测管理与技术， 2013(6).

[5]高瑞坤，汤琳，付强.水中粪大肠菌群快速检测方法-固定底物酶底物法与多管发酵法的比较[J].中国环境监测，2008，24 ( 4): 39-41.

Analysis of the Advantages and Influential Factors of Fecal Coliform Determination in Water by Enzyme Substrate Technique

YANG Xiao-ran, ZHU Chao, ZHANG Fu-hai, HU Ya-qing, ZHANG Min

(Anhui Provincial Environmental Monitoring Centre, Hefei Anhui 230061, China)

The enzyme substrate technique and multi-tube fermentation technique to detect the fecal coliform in various types of water were applied. The results showed that the two methods were no significant difference in statistics. The enzyme substrate technique had the advantages of rapidity and easy operation. Its detection sensitivity was higher than multi-tube fermentation technique. The enzyme substrate technique could use mature culture medium and regents with simple operation without confirmation test. The MPN value of fecal coliform could be identified after 20 hours. Meanwhile, there were no impacts of laboratory environment with bacteria or not on the experimental results. However, the culture temperature would affect the results.

fecal coliform; environmental monitoring; enzyme substrate technique; multi-tube fermentation technique; rapid detection; influential factor

2017-03-17

杨晓冉(1980-)，女，安徽合肥人，工程师，硕士，主要从事水质环境监测工作。

X83

A

1673-9655(2017)05-0087-04