萘酚AS-TR磷酸酯法酸性磷酸酶染色在肌病诊断中的应用

刘文文， 陈裕庆， 张文敏， 高美钦，2



萘酚AS-TR磷酸酯法酸性磷酸酶染色在肌病诊断中的应用

刘文文1， 陈裕庆1， 张文敏1， 高美钦1，2

萘酚AS-TR磷酸酯； 酸性磷酸酶； 酶组织化学； 肌疾病

酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)主要位于机体各组织中的溶酶体内，吞噬细胞胞质内也含有丰富的ACP。此酶在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解，最适合的pH为4.8～5.2。显示ACP的常用方法有Leder and Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法与Holtgn Bitensky改良磷酸铅法。现笔者选用改良萘酚AS-TR磷酸酯法应用于骨骼肌活检标本的病理诊断中，效果满意，值得推广应用，现报告如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2014-2016年临床送检的骨骼肌活检组织共400例，选取其中有代表性的3例。例1为男性，60岁，病理诊断“未见明显特异性改变”；例2为女性，21岁，病理诊断“多发性肌炎”；例3为女性，26岁，病理诊断“糖原累积性肌病”。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器和试剂 酸度计(含数字式)(PHS-3C，上海第二分析仪器厂)；恒冷切片机(HM 550 OMVPD，美康国际有限公司)；磁力加热搅拌器(78型，上海市南汇电讯器材厂)。试剂：OCT冰冻切片包埋剂(1603966，德国Leica公司)；异戊烷(14090414)、亚硝酸钠(20160918)、对品红(F20111207)及二甲基甲酰胺(T20160913)(国药集团化学试剂有限公司)；巴比妥钠(Z6306，成都西亚化工股份有限公司)；醋酸(160223)及盐酸(150131)(上海西陇化工股份有限公司)；萘酚AS-TR磷酸酯(117K5308V，美国Sigma公司)。

1.2.2 配制试剂 参照文献[1]的方法配制试剂。4%对品红盐酸溶液：对品红1 g，2 mol/L盐酸加至25 mL，混合后轻轻摇动使对品红完全溶解，第2天过滤后使用。4%亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠40 mg，蒸馏水加至1 mL，每次临用时配制。六偶氮对品红溶液：4%对品红盐酸溶液6滴，4%亚硝酸钠溶液1 mL，Michaelis巴比妥醋酸盐缓冲液(pH=7.6)30 mL。取一洁净烧杯，先滴入对品红液6滴，随后逐滴滴入亚硝酸钠溶液，边滴边充分摇动，静置2 min使其充分偶氮化，再加入巴比妥醋酸盐缓冲液30 mL，最后用2 mol/L盐酸调节至pH为5.0～5.1。萘酚AS-TR磷酸酯溶液：萘酚AS-TR磷酸酯10 mg，二甲基甲酰胺1 mL，二者混合并稍摇动使其充分溶解。孵育液：萘酚AS-TR磷酸酯溶液1 mL，六偶氮对品红溶液30 mL，二者充分混合后，调节pH为4.8～5.2，用前过滤。

1.2.3 制片及染色方法 肱二头肌或股四头肌活检组织，直径0.5 cm，长度1 cm，用OCT包埋剂包裹组织，经液氮预冷的异戊烷速冻，用低温恒冷切片机在-22 ℃下切片，厚度6～8 μm。用电吹风风干组织切片上的水雾，将切片浸入孵育液，于37 ℃恒温水浴箱内孵育。30～60 min后用蒸馏水洗去孵育液，Gill苏木精染色1 min，流水冲洗15 min。常规脱水透明，中性树胶封固。

1.3 结果 ACP活性细胞质呈红色，胞核蓝色，在正常的肌纤维中为阴性，在退变坏死的肌纤维中呈阳性反应，在Ⅱ型糖原累积病时也呈阳性反应(图1)。

2 讨 论

2.1 染色原理 ACP广泛分布于机体各个组织，它主要位于溶酶体内，是溶酶体的标志酶。在酸性条件下，ACP水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚AS-TR和磷酸，萘酚AS-TR与六偶氮对品红偶联形成红色的不溶性复合物，沉淀在酶活性的部位而显示出来。此酶在正常的肌纤维中为阴性，溶酶体活跃时，酶活性部位呈红色，在退变坏死的肌纤维中此酶活性增高显示阳性反应；在酸性麦芽糖酶缺陷导致溶酶体极度活跃的Ⅱ型糖原累积病时呈现阳性，此病的成人型有时糖原的蓄积不太明显，缺乏特异性肌病理表现，但ACP染色能发现大量高活性纤维，对诊断有很大帮助；吞噬细胞内含有丰富的ACP，呈阳性反应；此外，再生纤维及蜡样脂褐素沉积症的蓄积物也呈阳性反应[1-3]。

A1，A2：正常骨骼肌组织；B1，B2：退变坏死骨骼肌组织； C1，C2：糖原累积性肌病骨骼肌组织.图1 不同骨骼肌组织的H-E及ACP染色结果( ×200)Fig 1 H-E and ACP staining results of different skeletal muscle tissues ( ×200)

2.2 注意事项

2.2.1 组织速冻及冷冻切片 为了避免因固定对酶活性的影响，本实验采用恒冷切片直接显示酶的方法。应注意：(1)肌肉活检组织应及时妥当速冻，防止酶活性的丢失及冰晶形成；(2)切片温度恰当，一般恒冷室温度为-22 ℃，冻头温度为-20 ℃；温度太高，切片容易皱折，温度过低，切片容易产生破洞；(3)切好的组织片应置-20 ℃保存，以免酶的扩散或失活，从冰箱取出的切片应立即用冷风吹干，以免产生皱折，影响观察。

2.2.2 试剂配制 (1)4%对品红盐酸溶液配置完成后一定要过滤，此溶液置冰箱保存可使用1年以上；(2)4%亚硝酸钠溶液需临用前配制；(3)偶氮化过程中2种溶液的顺序不能颠倒，否则配制失败；(4)可用萘酚AS-BI磷酸酯代替萘酚AS-TR磷酸酯；(5)ACP最适合pH值为4.8～5.2，pH值的准确度非常重要。

2.2.3 孵育的温度及时间 本实验酶反应的最合适温度为37 ℃，加热可加快酶反应速度，但是过热会使酶蛋白变性，其反应速度反而下降，同时影响酶反应结果[4]。孵育时间一般为30～60 min，因受试剂厂家、批号及操作的影响，应根据实际情况摸索最佳时间。

[1] 梁英杰，凌启波，张 威. 临床病理学技术[M]. 北京：人民卫生出版社，2011：247-249.

[2] 李作汉，张 平. 神经肌肉肌病的临床与病理[M]. 北京：人民卫生出版社，2007：23.

[3] 埜中征哉，著. 吴士文，译. 临床肌肉病理学[M]. 北京：人民军医出版社，2007：29.

[4] 高美钦，张文敏，晋 雯. 还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶的染色方法[J]. 福建医科大学学报，2002，36(4)：464.

(编辑：何佳凤)

2017-01-12

福建医科大学 基础医学院 1.病理学系，福州 350122；2.科研中心，福州 350004

刘文文，女，助理实验师，医学硕士

高美钦. Email: gaomq823@sina.com

R345.61； R392.11； R746； R977.3

B

1672-4194(2017)03-0202-02