五味子乙素调控NF-κB通路对顺铂致HK-2细胞炎症损伤的保护作用

李 佳，尹一子，简晓顺，林 蔚

（广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510095）

·实验研究·

五味子乙素调控NF-κB通路对顺铂致HK-2细胞炎症损伤的保护作用

李 佳，尹一子，简晓顺，林 蔚

（广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510095）

目的 研究五味子乙素对顺铂致HK－2细胞炎症损伤的保护作用及相关机制。方法 以不同浓度的五味子乙素及顺铂干预人肾小管上皮HK－2细胞，CCK－8法检测细胞活性，Hoechst33258荧光染色法观察细胞形态变化，Western blot法检测NF－κB活化，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞上清液中炎性细胞因子[肿瘤坏死因子－α(TNF－α)、白细胞介素1β(IL－1β)、白细胞介素6(IL－6)]水平，实时荧光聚合酶链反应(RT－PCR)法检测细胞中TNF－α，IL－1β，IL－6的mRNA表达。结果 与对照组相比，顺铂组细胞活性显著下降，细胞形态明显改变；五味子乙素呈浓度依赖性地减轻顺铂的细胞毒性作用。同时，五味子乙素能显著抑制顺铂所致NF－κB活化及炎性细胞因子（TNF－α，IL－1β，IL－6）在细胞上清液中及mRNA表达的升高。结论 五味子乙素能通过调控NF－κB通路对抗顺铂所致肾小管上皮细胞的炎症损伤。

五味子乙素；顺铂；肾毒性；炎性反应；NF－κB通路；HK－2细胞

顺铂（cisplatin）是目前临床常用的广谱抗癌药，治疗各种实体瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等均效果良好[1]。因有肾毒性，其临床应用受到极大限制[2－3]，目前临床普遍使用水化法预防顺铂肾毒性，但仍有25%～35%的患者在首次接受顺铂治疗后出现肾功能减退[4]，这往往导致后续化学治疗（简称化疗）剂量的降低或化疗周期的延迟、终止，影响整体治疗效果。因此，有效防治肾毒性是临床使用顺铂化疗过程中亟待解决的问题[5]。五味子乙素（schisandrin B，Sch B）是从中药五味子成熟果实中提取的一种二苯环辛二烯类木脂素成分，具有显著的抗氧化和抑制细胞损伤凋亡作用。前期研究表明，其能显著减轻顺铂对人肾小管上皮HK－2细胞的毒性，且这一作用与五味子乙素激活Nrf2／ARE通路和对抗氧化应激损伤有关[6]，但其作用机制尚未完全阐明。炎症损伤是顺铂肾毒性的细胞生物学机制之一[7]。本研究中以HK－2细胞为模型，探讨五味子乙素通过调控NF－κB通路、对抗炎症损伤而减轻顺铂肾毒性的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：HK－2细胞由中山大学附属第一医院肾病实验室聂静教授惠赠；顺铂（99.0%，美国Sigma公司）；五味子乙素（99.1%，上海融禾医药科技发展有限公司）；DMEM／F12培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；CCK－8试剂盒，Hoechst33258染色试剂，细胞蛋白抽提试剂盒，BCA蛋白浓度测定试剂盒（杭州碧云天公司）；I－κB，β－actin抗体，抗小鼠IgG （H＋L）二抗（美国 CST公司）；肿瘤坏死因子 －α(TNF－α)、白细胞介素 1β(IL－1β)、白细胞介素 6 (IL－6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒（美国R＆D公司）；RNA提取及实时荧光聚合酶链反应(RT－PCR)检测试剂（日本Takara公司）；其余试剂为分析纯。

仪器：CO2培养箱（美国Thermo公司）；荧光倒置显微镜（德国Leica公司）；蛋白电泳仪（美国 BIO－RAD公司）；Real－time PCR仪（瑞士罗氏公司）。

1.2 方法

细胞培养：HK－2细胞置含10%胎牛血清、100U／mL青霉素、100μg／m L链霉素的DMEM／F12培养液中，在5%CO2及37℃培养箱中培养，隔天换液。取处于对数生长期的细胞用于试验。

CCK－8法检测细胞活性：取对数生长期的HK－2细胞，以细胞数1×104个／mL（200μL／孔）接种于96孔板，置5%CO2及37℃培养箱中培养24 h后更换含5%胎牛血清培养基，加入不同浓度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素预孵育12 h后，除尽培养基，顺铂（30μmmol／L）孵育24 h，同时设置空白对照组、溶剂对照组、调零组。孵育结束后，每孔加入20μLCCK－8溶液，置5%CO2及37℃培养箱中继续孵育1 h，酶标仪450 nm波长检测吸光度。每组设6个副孔，重复3次，结果以细胞存活率表示，细胞存活率(%)＝试验组吸光度值／空白对照组吸光度值×100%。

Hoechst33258荧光染色法观察细胞形态：将HK－2细胞接种于 24孔板中，加入不同浓度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素预孵育 12 h后以顺铂（30μmmol／L）孵育24 h。处理结束后弃去培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，加入0.5 m L Hoechst 33258染色液，染色10min。去除染色液，PBS洗涤2次，吸尽液体，荧光倒置显微镜观察并拍照。

Western blot法检测细胞中I－κB蛋白水平：不同浓度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素预孵育12 h后以顺铂（30μmmol／L）处理HK－2细胞24 h，弃去培养液，根据试剂盒说明书提取、分离蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量样品进行SDS－PAGE电泳分离，转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入稀释的一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次（每次10min），二抗室温孵育1 h，ECL显色。

ELISA法检测细胞上清液中TNF－α，IL－1β，IL－6水平：不同浓度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素预孵育12 h后以顺铂（30μmmol／L）处理HK－2细胞24 h，吸取培养基至离心管中，2 500 r／min离心5 min，收集上清。根据试剂盒说明书，夹心ELISA法测定上清液中TNF－α，IL－1β，IL－6水平。

RT－PCR法检测TNF－α，IL－1β，IL－6mRNA水平：不同浓度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素预孵育12 h后，以顺铂（30μmmol／L）处理HK－2细胞24 h，弃去培养液，用Trizol等试剂提取总RNA，按照逆转录试剂盒操作步骤进行反转录反应。所得cDNA在RTPCR仪上进行反应。每次扩增的同时设置cDNA的阴性对照。将PCR产物作熔解曲线，以证实以上PCR反应产物特异性良好。统计△Ct值以比较各组mRNA水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 细胞活性

顺铂（30μmmol／L）处理HK－2细胞24 h后，与溶剂对照组相比，细胞活性明显降低（P＜0.01）；而不同浓度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素能显著减轻顺铂所致细胞活性降低，且作用呈浓度依赖性（图1）。

注：A组为溶剂对照组，B为五味子乙素2.0μmol／L组，C组为顺铂组，D组为顺铂 ＋五味子乙素 0.5μmol／L组，E组为顺铂 ＋五味子乙素 1.0μmol／L组，F组为顺铂 ＋五味子乙素2.0μmol／L组，图2至图5同。与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与顺铂组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；图3至图5同。

2.2 细胞形态

对照组HK－2细胞核数量密集，排列紧密，呈现正常的蓝色。顺铂（30μmmol／L）处理 HK－2细胞 24 h后，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色发白，排列不紧密，细胞数量明显减少。不同浓度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素能抑制顺铂所致细胞膜破裂（图2）。

2.3 细胞中I－κB蛋白水平

顺铂（30μmmol／L）处理HK－2细胞24 h后，I－κB蛋白水平与对照组相比明显下降（P＜0.01），表明NF－κB活化增强，不同浓度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素能呈浓度依赖性地抑制顺铂所致NF－κB的活化（图3）。

图2 不同浓度五味子乙素对顺铂所致细胞形态改变的影响

2.4 细胞上清液中TNF－α，IL－1β，IL－6水平

顺铂（30μmmol／L）处理 HK－2细胞 24 h后，HK－2细胞培养上清液中炎性因子TNF－α，IL－1β，IL－6的水平均升高（P＜0.01），而不同浓度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素给药组细胞上清液中各炎性细胞因子浓度与顺铂组相比显著降低，且呈浓度依赖性（图4）。

2.5 TNF－α，IL－1β，IL－6 m RNA水平

顺铂（30μmmol／L）处理HK－2细胞24 h后，细胞内各炎性细胞因子（TNF－α，IL－1β，IL－6）的 mRNA相对表达水平升高（P＜0.01），而不同浓度的五味子乙素组上述炎症介质的mRNA表达水平较顺铂组降低，趋势与细胞培养上清液中的浓度变化一致（图5）。

图3 不同浓度五味子乙素对顺铂所致I－κB降解的影响（n＝3）

3 讨论

目前认为，顺铂致肾毒性的细胞生物学机制涉及细胞凋亡、DNA损伤、炎性反应、氧化应激等[7]。近年来许多研究发现，炎性反应在诱发顺铂肾毒性中发挥了重要作用[8]。顺铂在肾小管细胞中通过促进抑制性蛋白I－κB的降解，激活促炎转录因子NF－κB，诱导一系列炎症因子的表达，引发炎性反应[9]。其中TNF－α是顺铂所致炎性反应中的关键因子，TNF－α在肾小管细胞中的表达增加，可激活整个炎性细胞因子网络，促进白细胞介素1β、白细胞介素4、白细胞介素6（IL－1β、IL－4，IL－6）的生成[10]。笔者在HK－2细胞模型中证实，顺铂能激活NF－κB，促进多种炎性细胞因子表达，造成炎症损伤，该结果与其他文献在整体动物实验中的报道一致[9－10]。

图4 不同浓度五味子乙素对顺铂所致细胞培养上清液中炎性细胞因子水平升高的影响（n＝3）

图5 不同浓度五味子乙素对顺铂所致炎性细胞因子mRNA表达升高的影响

五味子乙素是五味子有效成分中含量丰富、活性最强的化合物之一，不仅可通过增强线粒体功能与结构的完整性，表现出对细胞凋亡的保护作用，还可刺激机体细胞产生更多的抗氧化剂谷胱甘肽，并增加各种抗氧化酶的活性，抵抗毒性物质对心脏、肝脏、肾脏、大脑等细胞或组织的损伤[11]。此外，还有研究显示，五味子乙素具有抗癌活性。Wu等[12]的研究发现，五味子乙素通过Caspase－3途径诱导人肝癌细胞凋亡，下调热休克蛋白HSP70的表达，抑制肿瘤细胞增殖。Xu等[13]的研究则发现，五味子乙素在预防抗癌药多柔比星引起的慢性心脏毒性的同时，还能增加肿瘤细胞对多柔比星的敏感性，增强其抗肿瘤活性。目前，关于五味子乙素对抗药源性肾损伤的报道较少。有研究发现，五味子乙素能通过增加线粒体的抗氧化状态及结构、功能的完整性，减轻庆大霉素引起的严重肾脏损伤[14]。关于五味子乙素抗炎作用的报道较少，Rahul等首次发现五味子乙素在淋巴细胞中通过调节 NF－κB及 Nrf2发挥抗炎效果[15]。本研究结果显示，五味子乙素能抑制顺铂在HK－2细胞中诱导的NF－κB活化，抑制炎性细胞因子的表达，从而减轻顺铂对细胞的炎性损伤。

Nrf2／ARE通路除了与氧化应激密切相关，与炎性反应也有关联。Nrf2的激活可抑制NF－κB的活化，而Nrf2靶基因血红素加氧酶－1(HO－1)的激活则能减少白细胞的黏附、迁移及细胞因子的生成，还能诱导抗炎因子IL－10的生成。在五味子乙素对顺铂致肾损伤的保护作用中，Nrf2与NF－κB是否通过交互对话发挥协同作用，仍有待于进一步研究。

五味子乙素能抑制顺铂在HK－2细胞中诱导的NF－κB活化，抑制炎性细胞因子的表达，减轻顺铂对肾小管上皮细胞的炎症损伤。本研究结果为临床合理使用五味子乙素防治顺铂肾毒性提供了实验依据。

[1]Giaccone.G.Clinical perspectives on platinum resistance[J].Drugs，2000，59（Suppl4）：9－17.

[2]Fuertes MA，Castilla J，Alonso C，et al.Novel concepts in the development of platinum antitumor drugs[J].Curr Med Chem，2002，2（4）：539－551.

[3]Ren D，Villeneuve NF，Jiang T，etal.Brusatolenhances the efficacy of chemotherapy by inhibiting the Nrf2－mediated defensemechanism[J].PNAS，2011，108（4）：1433－1438.

[4]Luke DR，Vadiei K，Lopez－Berestein G.Role of vascular congestion in cisplatin－induced acute renal failure in the rat[J]. Nephrol Dial Transplant，1992，7（1）：1－7.

[5]Lee CK，Park KK，Chung AS，et al.Ginsenoside Rg3 enhances the chemosensitivity of tumors to cisplatin by reducing the basal level of nuclear factor erythroid 2－related factor 2－mediated heme oxygenase－1／NAD（P）H quinone oxidoreductase－1 and prevents normal tissue damage by scavenging cisplatin－induced intracellular reactive oxygen species[J].Food Chem Toxicol，2012，50（7）：2565－2574.

[6]李 梅，金 晶，李 佳，等.五味子乙素激活Nrf2／ARE通路对顺铂致HK－2细胞氧化应激损伤的保护作用[J].药学学报，2012，47（11）：1434－1439.

[7]Peres LA，da Cunha AD Jr.Acute Nephrotoxicity of cisplatin：molecularmechanisms[J].JBrasNefrol，2013，35（4）：332－340.

[8]Amirshahrokhi K，Khalili AR.Thalidomide ameliorates cisplatininduced nephrotoxicity by inhibiting renal inflammation in an experimentalmodel[J].Inflammation，2015，38（2）：476－484.

[9]Miller RP，Tadagavadi RK，Ramesh G，et al.Mechanisms of Cisplatinnephrotoxicity[J].Toxins（Basel），2010，2（11）：2490－2518.

[10]Ramesh G，Reeves WB.TNF－alpha mediates chemokine and cytokineexpression and renal injury in cisplatin nephrotoxicity[J].JClin Invest，2002，110（6）：835－842.

[11]Zhu SH，Wang Y，Chen MW，et al.Protective effect of schisandrin B against cyclosporine A－induced nephrotoxicity in vitro and in vivo[J].Am JChin Med，2012，40（3）：551－566.

[12]Wu YF，Cao MF，Gao YP，et al.Down－modulation of heat shock protein 70 and up－modulation of Caspase－3 during schisandrin B－induced apoptosis in human hepatoma SMMC－7721 cells[J].World JGastroenterol，2004，10（20）：2944－2948.

[13]Xu Y，Liu Z，Sun J，et al.Schisandrin B prevents doxorubicininduced chronic cardiotoxicity and enhances itsanticanceractivity in vivo[J].PLoSOne，2011，6（12）：e28335.

[14]Chiu PY，Leung HY，Ko KM.Schisandrin B enhances renalmitochondrial antioxidant status，functional and structural integrity，and protectsagainstgentamicin－induced nephrotoxicity in rats[J].Biol Pharm Bull，2008，31（4）：602－605.

[15]Checker R，Patwardhan RS，Sharma D，et al.Schisandrin B exhibits anti－inflammatory activity through modulation of the redox－sensitive transcription factors Nrf2 and NF－κB[J].Free Radic BiolMed，2012，53（7）：1421－1430.

Protective Effect of Schisandrin B for Protecting Cisp latin－Induced Inflamm atory Dam age of HK－2 Cells Through Regulating NF－κB Pathway

Li Jia，Yin Yizi，Jian Xiaoshun，Lin Wei
（Cancer Center of Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong，China 510095)

Objective To investigate the protective effect of schisandrin B against Cisplatin－induced inflammation damage in HK－2 cells and its related mechanism.M ethods After treated with various concentrations of schisandrin B and Cisplatin，viability of HK－2 cells was determined by CCK－8 assay；cellular morphology was evaluated by Hoechst 33258 staining；activation of NF－κB was detected by Western blot；levels of TNF－α，IL－1β，IL－6 in supernatants were measured by ELISA，mRNA expressions of TNF－α，IL－1β，IL－6 were detected by RT－PCR.Results Compared with the control group，the cell activity of the cisplatin group decreased significantly，and the cell morphology changed significantly.Schisandrin B dose－dependently reduced the cytotoxicity induced by cisplatin，at the same time，schisandrin B significantly inhibited the activation of NF－κB induced by Cisplatin and reversed the increase of levels of TNF－α，IL－1β，IL－6 in supernatants and mRNA expressions.Conclusion Schisandrin B can against Cisplatin－induced inflammation damage in HK－2 cells through regulating NF－κB pathway.

schisandrin B；Cisplatin；nephrotoxicity；inflammatory reaction；NF－κB pathway；HK－2 cell

R285.5；R287.1；R979.1

：A

：1006－4931(2017)12－0011－04

2016－11－09)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.003

广州医科大学博士启动项目[2013C64]。

李佳（1985－），女，博士研究生，主管药师，研究方向为肿瘤临床药学、药物毒理学，（电话）020－66673666－2045。