定性、定量方法测定养血注射液溶血性试验

侯超

（郑州市中医院制剂室，河南 郑州 450000）

定性、定量方法测定养血注射液溶血性试验

侯超

（郑州市中医院制剂室，河南 郑州 450000）

目的：观察养血注射液溶血作用。方法：肉眼观察法定性观察养血注射液的溶血性；同时采用分光光度法、体外红细胞计数法定量计算养血注射液的溶血率。结果：肉眼观察法中，养血注射液溶血作用较弱；分光光度法中，养血注射液溶血率低于3.5%；体外红细胞计数法中，养血注射液溶血率低于5%。结论：养血注射液溶血作用符合国家标准。

养血注射液；溶血试验；肉眼观察法；分光光度法；体外红细胞计数法

养血注射液是以四物汤中有效成分为原料药，配伍甘油等附加剂制备而成的化学结构明确、疗效确切的注射液，具有补血、养血、活血的功效，为了考察注射液的安全性，本试验开展了溶血性试验，为新药研发奠定基础。

1 仪器、试药与试验动物

1.1 仪器

UV-4802型双光束紫外可见分光光度计（尤尼克仪器有限公司）；POCH-100 ivd型全自动动物血液分析仪（希森美康医用电子有限公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；抗凝管（江苏康健医疗用品有限公司）；锥形瓶；移液枪；离心管；试管；镊子。

1.2 试药

0.9 %氯化钠溶液（福州海王福药制药有限公司）；养血注射液由福建中医药大学药剂科研实验室自制，蒸馏水由福建中医药大学药学院自制。

1.3 动物

昆明小鼠，清洁级，合格证号：SCXK（沪）2012-0002，福建中医药大学动物房提供，雌雄各半，18～22 g。

2 试验方法与结果

2.1 肉眼观察法定性观察

2.1.1 2%红细胞悬浮液的配制 采用抗凝管取健康小鼠血液3 mL，混匀，转移至10 mL离心管内，加1倍量0.9%氯化钠溶液，摇匀，1000～1500 r/min离心15 min，除去上清液，沉淀的红细胞再加入0.9%氯化钠溶液约5倍量，摇匀，1000～1500 r/min离心15 min，除去上清液，沉淀的红细胞再加入0.9%氯化钠溶液5倍量按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液制成2%（V/V）的混悬液，供试验用。

2.1.2 定性观察[1-3]取洁净试管7只，进行编号，1～5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。按下表所示依次加入2%红细胞悬液，0.9%氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置（37±0.5）℃的水浴锅中进行温育，并于第15 min，30 min，45 min，1 h，2 h及3 h观察溶血与凝聚反应。按表1中顺序加入各种溶液。

表1 试验安排 （mL）

2.1.3 结果判定 温育的过程中，若试管中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如试管下部为红色红细胞悬浮液，上部液体无色澄明，表明无溶血发生。

若供试品管红细胞沉降较对照管明显快，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。

2.1.4 试验结果 按照“2.1.1”～“2.1.3”中的试验方法，重复做3批，温育3 h后定性观察。结果见图1。

图1 3批注射液溶血试验肉眼观察

15 min时，3批样品1～6号试管均在液面约0.2 cm处出现分层，下部为红细胞悬浮液，上部为澄明溶液，颜色微红；7号试管为澄明红色，不分层。

30 min时，3批样品1～6号试管均在液面约0.3 cm处出现分层，下部为红细胞悬浮液，上部为澄明溶液，颜色微红；7号试管为澄明红色，不分层。

45 min时，3批样品1～6号试管均在液面约0.5 cm处出现分层，下部为红细胞悬浮液，上部为澄明溶液，颜色微红；7号试管为澄明红色，不分层。

1 h时，3批样品1～6号试管均在液面约0.6 cm处出现分层，下部为红细胞悬浮液，上部为澄明溶液，颜色微红；7号试管为澄明红色，不分层。

2 h时，3批样品1～6号试管均在液面约1.2 cm处出现分层，下部为红细胞悬浮液，上部为澄明溶液，颜色微红；7号试管为澄明红色，不分层。

3 h时，3批样品1～6号试管均在液面约2 cm处出现分层，下部为红细胞悬浮液，上部为澄明溶液，颜色微红；7号试管为澄明红色，不分层。

2.2 分光光度法定量计算

2.2.1 定量计算 按表1将温育了3 h后的各管溶液离心，取上清液，在分光光度计545 nm处，以蒸馏水为空白读取各管的吸光度值（OD）值。

2.2.2 结果判定 根据红细胞破裂释放出来的血红素在可见光波长段具有最大吸收的原理，采用分光光度法测定中药注射剂的溶血程度，可用下列公式计算各试验管的溶血率。

溶血率（%）＝（ODt－ODnc）/（ODpc－ODnc）×100%

式中，ODt：试验管吸光度；ODnc：阴性对照管吸光度；ODpc：阳性对照管吸光度。

2.2.3 试验结果 按照“2.1.1”～“2.1.3”以及“2.2.1”～“2.2.2”中的试验方法，重复做3批，温育3 h后，定量计算结果见表2，表3。

表2 3批试验定量计算结果（吸光度）

表3 3批试验定量计算结果（溶血率）

注：溶血率（%）＝[(空白对照管红细胞数-供试品管红细胞数)/空白对照管红细胞数]×100%

2.3 体外红细胞计数法定量计算

2.3.1 小鼠10只，摘眼球取血，将所采血液置抗凝管中，混匀，共5 mL，待用。

2.3.2 取5 mL试管6只，编号，1～4号管为供试品管，5号管为空白对照管，6号管为阴性对照管。见表4。

表4 试验安排 （mL）

按表4依次加入血液、养血注射液、生理盐水，混匀，分别于第15 min，30 min，1 h，2 h，4 h及8 h后进行血常规检查，得红细胞（RBC）数值，并计算溶血率。

2.3.3 按照“2.3.1”和“2.3.2”中的试验方法，重复做3批，结果见表5和表7。

表5 体外红细胞计数法第1批试验数据

表6 体外红细胞计数法第2批试验数据

表7 体外红细胞计数法第3批试验数据

3 讨论

3.1 肉眼观察法

3批样品中，7号试管均一直为澄明红色，不分层，表明发生溶血。1～6号试管中红细胞随着时间的延长而逐渐沉淀下部，上部液体澄清，并且1～5号供试品管上部澄明液体颜色与6号阴性对照管上部澄明液体颜色一致，表明养血注射液的溶血作用较弱。

3.2 分光光度法

3批样品中，采用分光光度法测定养血注射液的溶血程度，进行定量计算。结果1～5号供试品管的溶血率均低于3.5%，表明养血注射液的溶血作用较弱。为了增加可靠性，该溶血试验连做3批，结果3批溶血率均低于3.5%，符合国家溶血不得＞5%规定的要求[4]，且稳定性好，表明养血注射液溶血作用较弱，安全性较好。

3.3 体外红细胞计数法

通过测定6号阴性对照管中RBC的值为0，表明养血注射液对血液测定无干扰。3批样品中，1～4号管的溶血率均符合国家溶血率不得＞5%规定的要求，且随着时间的推移，溶血率并没有升高，表明养血注射液溶血性较弱，安全性较好。

本试验在经典肉眼观察法定性观察注射液溶血性的基础上，进一步通过分光光度法、体外红细胞计数法定量计算注射液的溶血率[5-7]，使得试验方法更科学、严谨，试验数据更有说服力。

[1] 姜允申,肖杭,唐玲芳.巯甲丙脯酸的血管刺激与溶血试验[J].海峡药学,1994,6(2):20-21.

[2] 吴国土,林秀珍,林建忠,等.注射用司帕沙星的溶血试验[J].海峡药学,2003,15(4):25-26.

[3] 曹继军.乳酸左氧氟沙星注射液溶血试验[J].中国冶金工业医学杂志,2007,24(3):338-339.

[4] 《中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则》课题研究组[S].2005:25.

[5] 韩雪松,刘莹,战德松.溶血试验评价奥氏体无镍不锈钢生物相容性[J].沈阳医学院学报,2010,12(2):87-89.

[6] 吴婷,王文佳,李薇.丹参川芎嗪注射液溶血试验及体外细胞毒性分析[J].今日药学,2014,24(10):716-718.

[7] 李逢春.盐酸氨溴索注射液安全性评价研究[J].中国实用医学,2014,9(19):258-259.

本文编辑：鲁守琴

Qualitative and Quantitative Tests for Hemolysis of Yangxue Injection

Hou Chao
(Manufacturing Laboratory, Zhengzhou Hospitol of Traditional Chinese Medicine, Henan Zhengzhou 450000, China)

Objective：To observe Hemolytic effect of Yangxue Injection.Methods：The hemolysis of yangxue Injection was observed visually, while the hemolysis rate was determined by spectrophotometry and red blood cell count in vitro.Results：Weak hemolysis was observed visually. However, the hemolysis rate was less than 3.5% by spectrophotometry, and less than 5% by red blood cell count in vitro.Conclusion：Hemolytic effect of yangxue injection is in line with national standards.

Yangxue Injection; Hemolysis Test; Visual Observation; Spectrophotometry; Red Blood Cell Count in Vitro

R927

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.05.015

2017 - 04 - 04

侯超，男，硕士，中药师。研究方向：中药制剂与质量控制。E-mail：18838195935@163.com