薏苡仁提取物对裸鼠肝癌移植瘤生长的影响及机制

陈萍，胡伟结，游赣花，张闽闽(贵州医科大学附属肿瘤医院，贵阳550004；2贵州医科大学附属口腔医院；贵州省食品药品检验所)



·基础研究·

薏苡仁提取物对裸鼠肝癌移植瘤生长的影响及机制

陈萍1，2，胡伟结1，游赣花3，张闽闽1
(1贵州医科大学附属肿瘤医院，贵阳550004；2贵州医科大学附属口腔医院；3贵州省食品药品检验所)

目的 观察薏苡仁提取物对裸鼠肝癌移植瘤瘤体生长情况及血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响，探讨薏苡仁治疗肝癌的机制。方法 建立裸鼠肝癌模型，将24只成模裸鼠随机分成模型组、薏苡仁低剂量组、薏苡仁高剂量组各8只，分别给予生理盐水、0.08 g/mL的薏苡仁混悬剂、0.16 g/mL的薏苡仁混悬剂连续灌胃给药40 d。收集瘤体标本，测量肿瘤体积、瘤重，计算抑瘤率；HE染色法观察瘤体组织细胞形态；ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。结果 与模型组相比，薏苡仁低、高剂量组的瘤体积减小、瘤重降低(P均<0.01)；镜下见薏苡仁低、高剂量药组生长状态良好的肿瘤细胞数量明显减少，出现面积大小不等的核浓缩或核溶解的坏死细胞群。薏苡仁高剂量组血清TNF-α水平较模型组降低(P<0.05)，薏苡仁低剂量组与模型组比较无统计学差异(P>0.05)；薏苡仁低、高剂量组较模型组血清IL-1β水平均升高，IL-6水平均降低(P<0.05或<0.01)。结论 薏苡仁可能通过调节血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，进而有效抑制裸鼠肝癌移植瘤生长。

薏苡仁；肝肿瘤；移植瘤;肿瘤坏死因子α；白细胞介素1β；白细胞介素6；裸鼠

原发性肝癌(以下简称肝癌)主要包括肝细胞癌、肝内胆管细胞癌和肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等不同病理类型。在我国，肝细胞癌占肝癌的85%～90%[1]。我国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51%[2]。薏苡仁是禾本科植物薏苡的干燥成熟种仁。我们的前期研究发现，薏苡仁粉口服几乎无不良反应，仅个别患者在外敷时出现皮肤干燥或轻微脱屑，停用后症状消失[3]。2016年，我们通过观察口服薏苡仁对荷瘤裸鼠瘤体生长及细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响，旨在为薏苡仁治疗肝癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级BAL/c裸鼠30只，4～6周龄，雄性，体质量18～22 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。人肝癌SMMC-7721细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供。薏苡仁药材购于贵州同济堂药房，经麸炒炮制，粉碎，过300目药筛，用注射用水配成0.08 g/mL和0.16 g/mL的混悬剂备用。0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)。Thermo全波长酶标仪(美国Thermo公司)，台式冷冻高速离心机(德国5804R型Eppendorf)，BS210S电子天平(德国，赛多利思公司)，TNF-α、IL-1β及IL-6酶联免疫吸附试剂盒(联科生物技术有限公司)。

1.2 模型制作与分组处理 取对数生长期SMMC-7721细胞，用0.25%胰酶消化，PBS冲洗，离心收集细胞。用0.9%氯化钠注射液悬浮细胞，调整细胞密度为5×106/mL。每只裸鼠分别取细胞悬液0.2 mL接种于颈背部皮下，3 d后见瘤体长出。将成模的24只裸鼠随机分为模型组、薏苡仁低剂量组、薏苡仁高剂量组，每组8只。薏苡仁低、高剂量组分别给予0.08、0.16 g/mL的薏苡仁混悬剂灌胃，模型组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃，均0.5 mL/次、2次/d，连续40 d。

1.3 移植瘤体积、瘤重及抑瘤率的测算 观察3组荷瘤裸鼠实验期间的饮食和活动状态。末次给药24 h后采用颈椎脱臼法处死荷瘤裸鼠，完整剥离出裸鼠的瘤体。用游标卡尺测量瘤体最大直径LD和最小直径SD，以LD×SD2×0.5计算移植瘤体积。称取瘤体质量，计算抑瘤率，抑瘤率=(模型组平均瘤重-用药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%。

1.4 瘤体组织细胞形态学观察 将肿瘤用甲醛固定，石蜡包埋，切5 μm厚切片。行常规HE染色，镜下观察肿瘤细胞形态。

1.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测 裸鼠眼眶取血，离心分离血清，-20 ℃保存备用。采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 结果

2.1 三组移植瘤体积、瘤重及抑瘤率比较 三组荷瘤裸鼠在实验过程中，除模型组在最后6 d摄食量和活动量稍有减少外，薏苡仁低、高剂量组均无明显变化。与模型组比较，薏苡仁低、高剂量组的瘤体积缩小，瘤重减少(P均<0.01)。薏苡仁高、低剂量组间瘤体积和瘤重比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。薏苡仁低、高剂量组的抑瘤率分别为52.12%、56.63%，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 三组移植瘤体积、瘤重比较

注：与模型组比较，*P<0.05。

2.2 三组瘤体组织细胞形态 镜下见模型组大多数肿瘤细胞生长状态良好，呈多角形或不规则形，核大深染，核分裂象多见；薏苡仁低剂量组多数细胞出现坏死的初期表现核浓缩，少数细胞出现坏死的末期表现核溶解；薏苡仁高剂量组大多数细胞呈现核浓缩的坏死表现，且有大面积的核溶解坏死细胞群出现。

2.3 三组血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 薏苡仁高剂量组血清TNF-α、IL-6水平均低于模型组，IL-1β水平高于模型组；薏苡仁低剂量组血清IL-6水平低于模型组，IL-1β水平高于模型组(P<0.05或<0.01)。见表2。

表2 三组血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

肝癌因发病隐匿，确诊时多为晚期，患者预后较差。其发病机制主要与乙型或丙型肝炎病毒感染密切相关，非病毒性因素则与过度饮酒、发霉食物、不洁饮水等相关。目前研究认为，肝细胞癌的发病机制与原癌基因激活、抑癌基因的失活、多种分子信号通路异常活化、相关蛋白质异常表达等因素有关[4]。目前对肝癌的治疗多采用手术切除为主，介入、放疗、化疗等为辅的综合治疗方案，但高复发率、高病死率一直是困扰临床的棘手难题。

薏苡仁为禾本科植物薏苡的干燥成熟种仁。2015年版《中国药典》一部里载明薏苡仁饮片的功能与主治项为用于水肿、赘疣、癌肿等。且我国具有自主知识产权的中药注射用薏苡仁油(薏苡仁有效活性成分制剂)的说明书也明确载明用于原发性肝癌治疗。既往有报道指出，薏苡仁油注射液和薏苡仁脂肪酸在体外对肝癌细胞具有良好的抗肿瘤活性，其作用机制可能与其诱导细胞凋亡、上调抑癌基因、下调癌基因、抑制G2/M细胞周期有关[5，6]。我们的前期研究发现，薏苡仁可提高细胞免疫功能，调节T淋巴细胞的水平、恢复Th1/Th2亚群的动态平衡，发挥抗病毒作用[7]。国外学者[8]报道，薏苡仁提取物α-单亚麻酯有抗病毒作用。然而目前多见注射用薏苡仁油治疗肝癌的报道，鲜有内服薏苡仁报道。而注射用薏苡仁油存在脂过敏、静脉炎及血管硬化等不良反应，导致患者用药不便且痛苦。本研究显示，与模型组比较，薏苡仁低、高剂量组的瘤体积及瘤重均显著减少。表明不同剂量的薏苡仁内服均对人肝癌细胞移植瘤有一定的抑制作用。

流行病学调查表明，炎症是导致肿瘤发生发展的主要因素之一[9]。肝细胞癌是炎症相关性肿瘤，因此，探讨炎症与肝细胞癌的关系有助于筛选肝癌的治疗药物与治疗靶点。有研究指出在肝癌的炎性微环境中，TNF-α、IL-1β、IL-6细胞因子不仅可由肿瘤细胞分泌，还能产生于炎症反应过程。它们互为因果，相互促进对方的表达，共同组成和维持有利于肝癌细胞生长的炎性微环境。

TNF-α是炎症反应的始动因子，既能由单核/巨噬细胞、肥大细胞及淋巴细胞等多种细胞释放产生，还能以自分泌方法促进自身合成。其对多种有助于肿瘤细胞发生、发展及逃逸的因子高表达有诱导作用，是改变肿瘤细胞微环境的关键因素[10]。贾绮宾等[11]报道，肝癌患者血清TNF-α水平明显高于肝硬化患者，且治疗后随着病情好转而逐渐降低，随病情恶化而明显上升。表明抑制血清TNF-α水平的高表达可能成为有效治疗肝癌的新靶点。本研究结果显示，薏苡仁高剂量组血清TNF-α水平较模型组降低，表明高剂量薏苡仁能明显抑制血清TNF-α的高表达，从而减少炎性因子分泌，从而减小肿瘤体积、减轻瘤重等发挥抑瘤作用。虽然薏苡仁低剂量组血清TNF-α水平较模型组有所降低，但差异无统计学意义。提示高剂量薏苡仁降低血清TNF-α水平的作用更佳。

IL-1β是较强的炎症反应继发因子，其通过激活c-Jun氨基末端激酶促进肝星状细胞增殖并分泌细胞外基质。这种作用既有利于炎症、损伤的愈合，也会导致肝纤维化[12]。还有研究[13]认为，IL-1β细胞因子在肝脏慢性炎症中的高表达不仅可诱导其他细胞因子如IL-2、IL-6、TNF-α的分泌，引发免疫反应以清除病毒，也能促进病毒性肝炎演变的肝细胞性肝癌的发生、发展、侵袭与迁移。在肝癌的发展与转归过程中，IL-1β参与了肿瘤细胞分裂增殖、肿瘤侵袭转移、肿瘤细胞凋亡、机体免疫反应等,表现出了多样性的生物效应。本研究结果显示，薏苡仁高、低剂量组均能提高血清IL-1β水平，通过上调血清IL-1β表达，促进炎症减退和病毒清除。

IL-6是促炎细胞因子，它能通过刺激活化B细胞的增殖而分泌抗体,刺激T细胞的增殖及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化,刺激肝细胞合成急性期蛋白而参与炎症反应[14]。同时还能作用于肝内的免疫细胞和其他基质细胞，激活STAT3信号通路，使之表达更多的炎症因子如IL-6、TNF-α、IL-10等，维持有利于肝癌细胞生长的炎性微环境，促进肝癌进展[15]。李丹等[16]报道，IL-6具有提高肝癌细胞增殖、转移和侵袭能力的作用。Meta分析结果显示，肝细胞癌患者血清IL-6不但高于正常人，而且高于肝硬化患者和慢性肝炎患者，同时文献指出这个结果可为以IL-6细胞因子为靶点的抗炎治疗肝癌方案提供决策依据[15]。本研究结果表明，薏苡仁不同剂量组均具有下调荷瘤裸鼠血清IL-6表达的作用，提示薏苡仁可能通过下调血清IL-6水平，抑制肝癌细胞增殖或转移。

综上所述，薏苡仁可降低肝癌瘤体体积和瘤重、诱发瘤体细胞变性坏死，其机制可能是通过影响血清TNF-α、IL-6、IL-1β表达，减轻肝癌组织细胞的炎性损害，从而抑制肝癌的发生、发展及转移。

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贵州省科学技术基金项目(黔科合LH字2014-7144)；贵州省科学技术基金项目(黔科合J字2012-2357)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.008

R735.7

A

1002-266X(2017)26-0029-03

2016-12-12)