异补骨脂素对去卵巢大鼠骨代谢的影响研究

刘锐 杨小杰 李鑫 张超 高秋明

兰州军区总医院创伤骨科，甘肃 兰州 730050

补骨脂为豆科补骨脂属植物补骨脂(Psoralea corylifolia L．)的干燥成熟果实， 为《中国药典》收载的传统中药。中药补骨脂，别名和兰苋、胡韭子，其性温、味辛，具有补肾助阳，温中止泻，纳气平喘之功。其中主要活性成分补骨脂素(psoralen)和异补骨脂素(isopsoralen)等香豆素类成分，具有较强的光敏化作用和镇静、解痉、止血等作用，是治疗白癜风、斑秃、牛皮癣以及瘤样皮肤病的有效药物[1]。近来研究表明，异补骨脂素具有与雌激素类似的促进骨代谢效果，可控制机体的骨量流失状态从而达到治疗因骨量流失引起的骨质疏松症。因此，研究异补骨脂素对骨质疏松的治疗作用具有重要意义。本文旨在研究异补骨脂素对去卵巢大鼠骨代谢的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

3月龄SPF级雌性SD大鼠40只，购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK军2010-007。

1.2 实验试剂和仪器

主要试剂：异补骨脂素(中国药品生物制品检定所，含量测定用，批号为110738-201509)。水合氯醛(天津大茂化学试剂公司)，钙黄绿素(美国Sigma公司)，四环素(美国Sigma公司)，苯甲酸雌二醇(中国美仑生物，质量分数≥98%)，甲基丙烯酸甲酯(天津市凯信化学工业有限公司，中国)，邻苯二甲酸二丁酯(烟台市双双化工有限公司，中国)，过氧化苯甲酰(上海山浦化工有限公司，中国)，无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，中国)，二甲苯(天津市巴斯夫化工有限公司，中国)，辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥公司。

主要实验仪器有：主要仪器双能X线骨密度仪(GE 公司，美国)， 正置相差显微镜(奥林巴斯公司，日本)，SP1600 硬组织切片机(LEICA 公司，德国)，SB-5200DT 超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司，中国)，便携式真空泵，Image-ProPlus6.0(IPP6.0)Media Cybernetics，公司图片分析软件。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及处理： 3周龄SPF级雌性SD大鼠40只，由中国人民解放军第四军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK军2010-007。将大鼠随机分为4组，每组10只，分别为假手术组，模型组，异补骨脂素组和雌激素处理组(苯甲酸雌二醇0.2 mg/kg，皮下注射，每周1次)[2]。去卵巢大鼠模型的建立及药物处理： 3月龄雌性SD大鼠40只，体重210～230 g，10只作为假手术对照组，30只经腹手术双侧去卵巢后随机分为3组，分别为模型组，异补骨脂素组和雌二醇阳性对照组。除阳性对照组外，各组分别于去卵巢后6w后进行实验处理，异补骨脂素组每天用25 mg /kg灌胃1次，1周停1天；模型组，与药物组等体积生理盐水灌胃处理；假手术组不作处理。去卵巢雌二醇阳性对照组，手术当天按0.2 mg/kg体重皮下注射苯甲酸雌二醇1次，此后每周1次。饲养温度(22±2)℃，湿度60%～70%，饮用自来水，标准类饲料，不限制饮水和食量，所有大鼠随机分组后安置在塑料筐内。

1.3.2 骨密度及生物力学检测：药物灌胃处理第12周时，采用100 g/L 的水合氯醛，在实验大鼠腹腔注射3 mL/kg进行麻醉。将麻醉后的大鼠置于双能X线骨密度仪下检测其全身骨密度，后处死大鼠，分离股骨和椎体骨组织，分别置于双能X线骨密度仪下检测离体骨密度，生物力学检测。

1.3.3 骨形态分析：第12周处死动物，于处死前第14、13天及第4、3天分别皮下注射25 mg/kg四环素(美国Sigma公司)和5 mg/kg钙黄绿素(美国Sigma公司)作双荧光标记。大鼠处死后：取左胫骨用低速锯(Buehler LTD，USA)将其分为3段，其上段行额状面去掉胫骨粗隆后置70%酒精中固定24 h，经酒精脱水后，用甲基丙烯酸甲酯进行不脱钙骨包埋，并切成5μm薄片及l0μm厚片，厚片观察骨小梁骨量及组织结构，薄片脱钙后，行HE染色观察骨组织细胞[3]。骨形态计量学指标：①静态指标：骨小梁面积百分率，骨小梁宽度，骨小梁数量，骨小梁分离度。②反映破骨的动力学指标：破骨细胞数，骨小梁周长破骨细胞数。

1.3.4 血清ELISA检测：大鼠心脏取血，5000 r/min，离心15 min，留血清，-80℃保存；ELISA试剂盒对血清中骨钙素(osteocalcin，OC) 和抗酒石酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b，TRACP 5b)检测，标准曲线制备及样品测定方法按照说明书操作；于酶标仪上405 nm和450 nm处测定OD值，并通过标准曲线计算每孔中的TRACP 5b和OC的量。并用Image-ProPlus6.0(IPP6.0)图片分析软件进行骨形态计量学分析。

1.3.5 离体骨免疫组织切片及组织化学染色：组织切片：方法见参考文献[4]，取1.5 cm×1 cm×0.5 cm大小的骨组织，放入4% 中性缓冲甲醛液4℃固定24 h，然后入中性EDTA脱钙液(4℃冰箱内)脱钙，每3天换1次脱钙液，约2w后用大头针刺探脱钙骨标本，若能穿入骨密质即可流水冲洗，然后经70%乙醇1.5 h，80% 乙醇1.5 h，95% 乙醇1 h，无水乙醇I 30 min，无水乙醇Ⅱ 30 min；二甲苯I 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min；浸蜡(58～60℃)l h，石蜡包埋，制成蜡块，切成4 μm厚的石蜡切片，60℃温箱烤片1 h后再行染色。免疫组化染色：方法见参考文献[5]，石蜡切片脱蜡至蒸馏水，3% H202，甲醇液室温作用20 min后水洗；切片入1% 胃蛋白酶37 ℃孵育10 min；滴加50μL BSA，室温封闭20 min后甩干；滴加鼠抗BMP-2多克隆抗体4℃湿盒孵育过夜；PBS洗，滴加 Biotin 标记的羊抗鼠IgG 37℃湿盒孵育40min；PBS洗，滴加HRP标记的链霉亲和素分子37℃湿盒孵育30min；PBS洗，DAB/H202显色；自来水充分洗涤，蒸馏水洗；苏木精1min，水洗，1% 盐酸酒精分化后返蓝；蒸馏水洗后，梯度酒精彻底脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 骨密度测量及生物力学检测

骨密度测量及生物力学检测结果见表1、2。

表1 大鼠全身骨密度、股骨骨密度、椎骨骨密度测量结果(g/cm2，±s)Table 1 Results of whole body bone mineral density, femoral bone mineral density, and vertebral bone mineral density(g/cm2，±s)

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

表2 大鼠弹性模量、最大载荷、屈服强度测量结果Table 2 Results of elastic modulus, maximum load, and yield strength in rats

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.2 血清ELISA检测

血清ELISA检测见图1、2。

图1 血清中TRACP 5b的ELISA检测结果注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01Fig.1 The test results of serum TRACP 5b

图2 血清中OC的 ELISA检测结果注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01Fig.2 The test results of serum OC

2.3 免疫组织化学染色图片

免疫组化切片具有阳性结果，呈颗粒状或条块状的棕黄色(见图3、4)，定位准确，对比明显，背景浅，骨小梁结构完整、清晰，染色结果稳定可靠，敏感性高、特异性强，适合显微照相等。因此，该方法可作为骨组织的制片与免疫组化的标准化实验方法应用。

图3 OPG免疫组织化学染色A为模型对照组，B为药物处理组，C为阳性对照组，D为假手术组Fig.3 Immunohistochemical staining for OPGA. model control group; B. drug treatment group; C. positive control group; D. sham operation group

图4 RANKL免疫组织化学染色A为模型对照组，B为药物处理组，C为阳性对照组，D为假手术组Fig.4 Immunohistochemical staining for RANKLA. model control group; B. drug treatment group; C. positive control group; D. sham operation group

大鼠去卵巢后骨组织OPG表达迅速下降，而RANKL表达明显升高，由图3所示：与假手术组比较，模型对照组大鼠骨组织OPG表达显著升高；与模型组比较，异补骨脂素组大鼠骨组织OPG表达极显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。异补骨脂素组与阳性对照相比无统计差异。由图4所示：假手术组比较，模型对照组大鼠骨组织RANKL表达较高；与模型组比较，异补骨脂素组大鼠骨组织RANKL表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。异补骨脂素组与阳性对照相比无统计差异。

3 讨论

众所周知，绝经后妇女雌激素缺乏导致骨质疏松，雌激素替代疗法是当前常用抗骨质疏松药物，考虑到其副作用，如何寻找安全的抗骨质疏松药物就变成当务之急[6]。异补骨脂素作为补阳壮骨的天然化合物在骨研究领域得到众多的关注，苯甲酸雌二醇，是公认的抗骨质疏松药物。大鼠双侧卵巢切除是常用的绝经后骨量丢失模型。

本试验中，假手术组全身、股骨和腰椎骨密度均极显著高于模型组，说明去卵巢大鼠是研究骨质疏松症发病机制的良好模型。异补骨脂素与苯甲酸雌二醇体质量均高于模型组，对脏器湿质量无显著性影响。TRACP 5b 是破骨细胞分泌的特异性酶，OC 是成骨细胞分泌的特异性酶，异补骨脂素显著影响血清TRACP 5b 和OC的水平，表明能促进骨形成，抑制骨吸收。OPG、RANKL均可由成骨细胞和基质细胞表达，几乎所有重要的骨代谢相关激素和细胞因子均可以通过调节OPG和RANKL的表达发挥调节骨重建的作用。雌激素缺乏导致的多种细胞因子分泌异常是导致绝经后骨质疏松症的重要原因[7]。试验中，我们观察到大鼠去卵巢后股骨成骨细胞OPG表达迅速下降，而RANKL表达明显升高，OPG/RANKL比值前期明显低于对照组，其结果和曾天舒等[8]报道的大鼠去卵巢后骨髓源性破骨细胞形成在后期达到高峰相一致。去卵巢后立即给予雌激素可以使上述基因表达的异常恢复到接近正常水平[9]。口服异补骨脂素，注射苯甲酸雌二醇后，骨小梁数量有所增多，交联度致密，同时异补骨脂素组股骨生物力学、腰椎弹性模量、强度增加与骨组织微结构的改善有关。异补骨脂素组骨密度、生化指标、骨形态和生物力学平均值略低于阳性对照组，异补骨脂素组增高的骨密度可能与其较高的骨钙素表达、较强消退炎症反应能力有关，意味着较强的骨形成、抑制骨吸收能力使得其骨密度和骨微结构强势。异补骨脂素作用机制可能与扭转骨转换、消退炎症反应、活跃血管再生途径有关。王建华和翟远坤等[10,11]研究了异补骨脂素对体外大鼠成骨细胞增殖与分化的影响，然而异补骨脂素是如何作用于机体，如何被吸收，如何发挥其药理作用，如何参与细胞信号通路？未见报道，所以，如何进一步了解异补骨脂素作用的分子机理有待更深层次的研究。