载脂蛋白E基因多态性和脑出血的相关性

贾卓鹏，金 林，车红民

(西安医学院第一附属医院神经外科，西安 710077)



载脂蛋白E基因多态性和脑出血的相关性

贾卓鹏，金 林，车红民

(西安医学院第一附属医院神经外科，西安 710077)

目的 探讨血浆载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因多态性和脑出血的相关性。 方法 检测189例原发性高血压脑出血患者及61例健康对照ApoE基因多态性，患者依脑出血部位(脑叶、基底节、脑干、小脑)进行临床分型，比较ApoE基因型和等位基因频率与脑出血及其临床分型之间的关系；比较脑出血患者含有ε4等位基因型组与非ε4等位基因型组入院时GCS(Glasgow coma scale)评分及入院1月后GOS(Glasgow outcome score)评分。 结果 ①脑叶出血组等位基因ε4频率显著高于对照组(P<0.05)，其余组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。②含有ε4等位基因型脑出血组较非ε4等位基因型组脑出血入院时GCS无显著差异(P>0.05)，但入院1月后含有ε4等位基因型脑出血组GOS评分预后不良明显高于非ε4等位基因型组(P<0.05)。 结论 ApoE ε4等位基因增加了脑叶出血的风险，含有ε4等位基因型的脑出血患者预后不佳。

载脂蛋白E； 基因多态性； 脑出血

载脂蛋白E(ApoE)是血浆中重要载脂蛋白之一，具有多态性，参与机体脂质代谢及调节胆固醇平衡。脑组织中脂质和胆固醇的转运主要通过ApoE进行调节。现对于载脂蛋白E基因多态性和脑出血的相关性存在争论[1]。为进一步明确相关性，我们采用PCR-RFLP(限制性片段长度多态性聚合酶链反应)技术对原发性高血压脑出血和正常人群组ApoE基因多态性进行测定。

1 对象与方法

1.1 一般资料

选取2014-01～2015-10在我院住院的原发性高血压脑出血患者189例(男98例，女91例)，平均年龄(60.1±5.7)岁。原发性高血压脑出血严格按照1995年中国脑出血诊治指南[2]。对照组为同期门诊非心脑血管疾病健康体检者61例(男30例，女31例)，平均年龄(61.4±8.7)岁。所有研究对象均由本人或家属签署知情同意书，两组年龄、性别差异无统计学意义。排除标准：外伤、肿瘤、药物、血液病所致的脑出血者；自发性蛛网膜下隙出血；动静脉畸形、静脉窦血栓、颅内动脉瘤所致出血；发病后行外科治疗者；合并有肝肾、造血系统和内分泌系统等严重原发性疾病；合并阿尔茨海默病；入院前1周内使用调脂和降糖等药物者。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 对两组受检者，均抽取晨起7时空腹静脉血5 ml，3.8%柠檬酸钠抗凝。采用盐析法提取外周血白细胞的基因组DNA，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 ApoE基因多态性进行测定 ApoE基因具有多态性，包含E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E2/4、E3/4六种基因型。ApoE的PCR扩增引物序列如下[3]：上游引物5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3′;下游引物5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′。反应体积为25 μl，PCR扩增反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，58 ℃退火变性1 min，72 ℃延伸1 min，共32个循环，最后72 ℃延伸5 min。扩增产物于2%琼脂凝胶(溴化乙锭染色)上以120 V电压电泳20 min，于紫外灯下观察并摄影。

1.2.3 apoE基因型判定 限制性内切酶酶切反应体系为20 μl，反应终止后取酶切产物于10%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，并在紫外凝胶成像仪下观察结果并照相。参考标准物根据长度片段确定待测样品apoE基因型。等位基因频率采用平衡法：ε2=apoE E2/2+1/2(apoE E2/3+apoE E2/4)；ε3=apoE E3/3+1/2(apoE E2/3+apoE E3/4)；ε4=apoE E4/4+1/2(apoE E3/4+apoE E2/2)，即通过基因型频率计算等位基因频率，一个等位基因的频率等于它的纯合子频率与1/2杂合子频率之和。

1.2.4 GCS评分及GOS评分 脑出血患者入院时行GCS评分，发病1月时行GOS评分，其中4-5分为预后良好，1-3分为预后不良。

2 结果

2.1 ApoE基因型和等位基因频率在脑出血组与对照组间比较

脑出血组与对照组均以E3/3基因型出现频率最高,两组基因型与等位基因频率对比ε3等位基因频率减低，ε4等位基因频率增加，但差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。但在脑出血各临床分型中，脑叶出血组等位基因ε4频率显著高于对照组，且差异有无统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 脑出血与对照组间 APOE 基因型和等位基因频率比较 Table 1 Comparison of ApoE genotype and allele frequency between normal control group and cerebral hemorrhage group

组别nApoE基因型频率apoE等位基因频率E2/2E2/3E2/4E3/3E3/4E4/4ε2ε3ε4对照组610.016(1)0.115(7)0.033(2)0.704(43)0.163(8)0 0.0900.8430.098 脑出血组1890.016(3)0.116(22)0.079(15)0.619(117)0.132(25) 0.037(7)0.1130.7430.143 脑叶组620.016(1)0.129(8)0.097(6)0.500(31)0.161(10) 0.097(6)0.1290.6450.226* 基底节组670.015(1)0.104(7)0.075(5)0.672(45)0.120(8) 0.015(1)0.1040.7840.113 脑干组290 0.103(3)0.069(2)0.690(20)0.138(4)0 0.0860.8100.104 小脑组310.032(1)0.129(4)0.065(2)0.677(21)0.097(3)0 0.1290.7900.081

与对照组对比,*P<0.05

2.2 脑出血患者含有ε4基因型组与非ε4基因型组入院时GCS及入院1月后GOS对比

两组入院时GCS评分无统计学差异，但在入院1月后GOS评分时，含有ε4基因型组预后不良率增加，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

3 讨论

编码ApoE蛋白的基因位于19号染色体的长臂上,含有4个外显子及3个内含子，其构成具有多态性,其等位基因是ε2、ε3和ε4,它们相应编码合成ApoE蛋白的3种纯合子(E2/2、E3/3、E4/4)及三种杂合子(E2/3、E2/4、E3/4)[4]。其基因型的区别在于第112位和第158位上半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)的互换[5]。ApoE参与机体血脂代谢及调节胆固醇平衡，在动脉粥样硬化发生、发展过程中起着重要的作用[6]。载脂蛋白通过调节酶和受体活性来调控脂蛋白的代谢及脂质在血浆中的转运。脑是ApoE的第二大合成器官，主要由星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞合成[7]。因为脑组织中缺乏载脂蛋白A，所以ApoE是脑脊液中的主要载脂蛋白，承担着调节中枢神经系统脂代谢的重要功能。由于血脂和脂蛋白代谢异常在脑出血的发生及预后起着重要作用，故ApoE可能与脑出血的发生进展相关。

表2 脑出血ε4携带者与非ε4携带者入院GCS评分及入院1月后GOS评分对比

Table 2 Comparison of GCS and GOS between ε4 cerebral hemorrhage group and non-ε4 cerebral hemorrage group

组别 nGCS评分GOS评分[例(%)]预后良好预后不良ε4携带者4711.7±3.128(59.6)19(40.4)*非ε4携带者14212.1±2.4113(79.6)29(20.4)

与非ε4携带者对比,*P<0.05

目前，国内外越来越多的研究显示ApoE基因多态性与缺血性脑卒中具有相关性，但对于其与脑出血的关系研究，结果存在较大的分歧。国外一些学者发现ApoEε2和ε4等位基因与脑出血相关[8]。Kokubo等[9]发现日本农村人群中，ε2和ε4等位基因是脑出血的危险因素。也有一些研究认为Apo E与脑出血发病不相关[10]。本研究显示对于广义脑出血及常见的动脉粥样硬化相关基底节区出血，与ApoE基因多态性无明显相关性，但ε4等位基因与脑叶出血具有相关性。分析主要是因为apoE特别是apoE4易与具有神经毒性的β样淀粉蛋白Aβ结合,使之成为稳定的能够抵抗水解的复合物，影响Aβ的清除,淀粉样蛋白的沉积在脑血管壁能使血管中层变薄内膜增厚，导致血管的完整性受损，称之为脑血管淀粉样变(CAA)[11]。CAA所致脑出血多为脑叶出血。

ApoE不仅在血脂代谢中具有重要意义，而且还参与神经细胞修复与免疫调节作用，具有重要的病理生理意义。本研究显示携带ApoEε4脑出血患者入院时GCS评分与非ε4携带者对比无差异性，提示其并不影响发病时病情程度，但携带ApoEε4脑出血患者预后不良的比例明显增高，具有差异性。ApoE在脑内参与磷脂的代谢，维持了细胞间脂类的重新分布及胆固醇内环境的稳定，并参与神经的发育及神经细胞损伤后的修复再生时的脂质活动以及脂质免疫调节和细胞调节[12]。

本研究表明，ApoE基因多态性不仅与脑叶出血的发生有关，而且与脑出血的预后相关。目前，脑出血的预防多是针对一些传统危险因素的控制和预防，而研究ApoE基因多态性对脑出血发病机制的认识，有利于通过对分子遗传学的危险因素的识别进行脑出血的一二级预防。

[1] 戴晓凤,李壮苗,黄瑞敏,等.脑卒中与载脂蛋白基因相关性研究近12年文献计量分析[J].中国全科医学,2015,18(32):4017-4020.

[2] 中华神经科学会，中华神经外科学会.脑血管疾病分类(1995)[J].中华神经外科杂志，1996，29(6):376-380.[3] Hixson JE,Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage withHhaⅠ[J].J Lipid Res,1990,31(3):545-8.

[4] 汤吉力,赵继宗.载脂蛋白E多态性和脑血管疾病[J].国外医学脑血管疾病分册,2002,10(3):198-200.

[5] 刘秉文,陈俊杰.医学分子生物学[M].北京:中国协和医科大学出版社,2000:68-78.

[6] Smith JD.Apolipoprotein E4:an allele associated with many diseases[J].Ann Med,2000,32(2):118-127.

[7] Linton MF,Gish R,Hubl ST,etal.Phenotypes of apolipoprotein B and apolipoprotein E after liver transplantation[J].J Clin Invest,1991,88(1):270-281.

[8] Ali SM,Dunn E,Ostveen JA,etal.Induction of apolipoprotein E mRNA in the hippocampus of the gerbil after transient globalischemia[J].Brain Res Mol Brain Res,1996,38(1):37-44.

[9] Kokubo Y,Chowdhury AH,Date C,etal.Age-dependent association of apolipoprotein E genotypes with stroke subtypes in a Japanese rural population[J].Stroke,2000,31(6):1299-1306.

[10] Nakata Y,Katsuya T,Rakugi H,etal.Polymorphism of angiotensin converting enzyme,angiotensinogen,and apolipoprotein E genes in a Japanese population with cerebrovascular disease[J].Am J Hypertens,1997,10(12 Pt 1):1391-1395.

[11] Carcia C,Pinhoe Melo T,Rocha L,etal.Cerebral hemorrhage and apoE[J].J Neurol,1999,246(9):830-834.

[12] Jiang Y,Sun X,Xia Y,etal.Effect of ApoE polymorphisms on early responses to traumatic brain injury[J].Neurosci Lett,2006,408(2):155-158.

Correlation between apolipoprotein E gene polymorphism and cerebral hemorrhage

JIA Zhuopeng，JIN Lin，CHE Hongmin

(DepartmentofNeurosurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China)

ObjectiveTo explore the correlation between the plasma apolipoprotein E(ApoE)gene polymorphism and the cerebral hemorrhage.MethodsPlasma apolipoprotein E gene polymorphism was detected in 189 hypertensive patients with cerebral hemorrhage and 61 healthy controls.The relationships of ApoE genotype and allele frequency with the cerebral hemorrhage were analyzed.The Glasgow coma scale(GCS)score at the admission and Glasgow outcome score(GOS)score at 1 month after admission were compared among the cerebral hemorrhage patients with epsilon 4(ε4)alleles and without the epsilon 4 alleles.Results① The frequencies of epsilon4 alleles in cerebral lobes hemorrhage group were significantly higher than that in normal control group(P<0.05).② There was no significant difference in GCS between cerebral hemorrhage patients with epsilon 4(ε4)alleles and without the epsilon 4 alleles at the admission(P>0.05).The rate of defective prognosis in the cerebral hemorrhage with ε4 was significantly higher than that of patients without ε4 at 1 month after the admission(P<0.05).ConclusionThe subjects carrying ApoE epsilon4 alleles is liable for incidence of cerebral lobe hemorrhage,and the cerebral hemorrhage patients with ε4 may have poor prognosis.

apolipoprotein E； gene polymorphism； cerebral hemorrhage

西安医学院第一附属医院科研基金资助项目(XYFY13-10)

贾卓鹏，男，1978-10生，硕士，主治医师，E-mail：kenny19781004@163.com

2016-11-17

R743.34

A

1007-6611(2017)04-0365-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.014