奎尼丁对HEK293细胞hERG电流和hERG蛋白的影响

霍建华,郭雪艳,强 华,刘 平,白 玲,马爱群

(1西安交通大学医学院第一附属医院心内科,西安 710061;2陕西省人民医院消化科;*通讯作者,E-mail:huojianhua2005@126.com)



奎尼丁对HEK293细胞hERG电流和hERG蛋白的影响

霍建华1*,郭雪艳2,强 华1,刘 平1,白 玲1,马爱群1

(1西安交通大学医学院第一附属医院心内科,西安 710061;2陕西省人民医院消化科;*通讯作者,E-mail:huojianhua2005@126.com)

目的 观察奎尼丁对hERG电流和hERG通道蛋白表达的影响,进一步明确其导致长QT间期综合征的机制。 方法 用脂质体转染法将含有hERG基因的质粒转入HEK293细胞,全细胞膜片钳技术记录电流和Western blot技术观察hERG通道蛋白表达的影响。实验分组:①HEK293细胞转染进质粒48 h时加入不同浓度(0，1，3，10 μmol/L)的奎尼丁,并进行膜片钳实验观察奎尼丁的瞬时作用。②HEK293细胞转染进质粒24 h时往培养基加入不同浓度(1，3，10 μmol/L)的奎尼丁,继续培养24 h洗脱奎尼丁后立即进行膜片钳及Western blot实验观察奎尼丁的慢性作用。 结果 ①1 μmol/L、3 μmol/L及10 μmol/L组的最大尾电流分别为(55.9±3.8)pA/pF、(35.7±3.2)pA/pF及(15.5±1.4)pA/pF,均明显小于对照(0 μmol/L)组(均P<0.05)。②不同浓度的奎尼丁孵育HEK293细胞后hERG电流无明显变化。Western blot观察到不同浓度奎尼丁作用下hERG蛋白表达无明显变化。 结论 奎尼丁对hERG电流有瞬时直接抑制作用,但并非影响hERG通道蛋白的表达来改变hERG电流。奎尼丁对hERG通道的直接抑制作用可能为其引起长QT间期综合征的根本机制。

长QT间期综合征； 奎尼丁； hERG； HEK293

人ether-a-go-go相关基因(human-ether-a-go-go-related gene,hERG)定位于染色体7q35-36,在心肌组织中高度表达,编码心肌细胞电压门控钾通道的α亚单位,α亚单位与MiRP1基因编码的β亚单位结合后产生快速激活延迟整流钾电流(rapidly activating component of delayed rectifier potassium current,IKr)[1,2]。多种药物(常规抗心律失常药物、抗生素、抗组胺药物以及抗精神病药物等)可阻断hERG通道引起药物性长QT综合征,心电图上表现为QT间期延长,T波异常,常引起尖端扭转型室性心动过速,临床上表现为反复发作性晕厥,甚至猝死。其主要机制是药物对hERG 钾通道产生直接抑制作用[3]。近年来发现,某些药物对hERG钾通道蛋白的转运有抑制作用,导致细胞膜hERG通道表达降低,从而发挥阻滞效应,引起长QT综合征[4]。奎尼丁是一种非选择性钠离子通道阻滞剂,为Ⅰa类抗心律失常药,由于其致心律失常作用严重影响了其在临床的引用。已有研究显示奎尼丁对hERG通道电流的直接抑制作用为其致心律失常作用的主要机制[5]。但其奎尼丁是否对hERG钾通道蛋白的表达转运有影响还未见报道。本研究利用分子生物学及膜片钳技术观察其对hERG钾通道的影响。

1 材料与方法

1.1 质粒及细胞株

质粒pcDNA3-WT-hERG、GFP-pRK5及HEK293细胞株由西安交通大学环境与疾病相关基因实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器

脂质体2000TM试剂盒购自美国Invitrogen公司。抗hERG抗体购自以色列Alomone公司。辣根过氧物酶标记的羊抗兔IgG抗体购自美国Sigma-Aldrich公司。奎尼丁购自美国Sigma-Aldrich公司。Axon-700B膜片钳系统、DigiData-1322A数模转换装置及pCLAMP9.2膜片钳数据处理软件均为美国Axon公司产品。Syngene Chemi-Genius成像系统购自英国SynGene公司。

1.3 HEK293细胞的培养、转染及处理

HEK293细胞培养在含有10%胎牛血清的高糖DMEM中。按照脂质体2000TM试剂说明进行操作,将pcDNA3-WT-hERG及GFP-pRK5(绿色荧光蛋白表达质粒,可作为pcDNA3-WT-hERG成功转染进细胞的指示剂)共转染进HEK293细胞。转染质粒48 h后立刻进行实验。实验分组:①观察奎尼丁的瞬时作用:HEK293细胞转染进质粒48 h时加入不同浓度(1 μmol/L、3 μmol/L及10 μmol/L)的奎尼丁进行膜片钳实验;②观察奎尼丁的慢性作用:HEK293细胞转染进质粒24 h时往培养基加入不同浓度(1 μmol/L、3 μmol/L及10 μmol/L)的奎尼丁,继续培养24 h洗脱奎尼丁后立即进行膜片钳及Western blot实验。

1.4 Western blot检测hERG蛋白表达

HEK293细胞培养在100 mm培养皿中,将真核表达载体pcDNA3-WT-hERG转染入细胞后第48小时时用PBS液洗涤两次,NP-40裂解液(20 mmol//L Tris-HCl at pH 8,137 mmol/L NaCl,10% glycerol,1% nonidet P-40 and 2 mmol/L EDTA)和蛋白酶抑制剂进行细胞裂解。Bradford 法测量细胞总蛋白浓度。蛋白样品用8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,一抗兔抗人HERG单克隆抗体4 ℃孵育12 h,二抗辣根过氧物酶标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育2 h,ECL发光液反应后利用Syngene Chemi-Genius成像系统照相。

1.5 全细胞膜片钳技术记录hERG电流

HEK293细胞转染进pcDNA3-WT-hERG及GFP-pRK5后48 h收获。实验前将HEK293细胞制备成单细胞悬液并置于浴槽中使其贴壁良好;全细胞电流利用Axon-700B单探头膜片钳放大器、DigiData-1322A数模转换装置及pCLAMP9.2膜片钳数据处理软件进行记录处理。细胞外液:137 mmol/L NaCl,4 mmol/L KCl,1.8 mmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,10 mmol/L Glucose,10 mmol/L HEPES(pH 7.4)。电极内液:130 mmol/L KCl,1 mmol/L MgCl2,5 mmol/L EGTA,5 mmol/L MgATP,10 mmol/L HEPES(用KOH 调节pH值在7.2)。实验在室温(22-24 ℃)下进行。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 奎尼丁对hERG电流的瞬时作用

HEK293细胞转染进质粒后48 h时加入不同浓度的奎尼丁后记录hERG电流。细胞的钳制电压是-80 mV,命令电压是-60 mV到+60 mV,阶跃是10 mV,每一个命令电压维持时间是2 s,紧接着细胞被钳制在-40 mV并持续5 s以获得尾电流[6]。从图1A中可以看出,不同浓度的奎尼丁作用下hERG电流的形态相一致。图1B显示的是激活电流的I-V曲线,可以看出各组细胞的最大激活电流的命令电压都是0 mV,且随着浓度的增加,奎尼丁对hERG电流有抑制作用越明显。图1C显示的是尾电流的I-V曲线,1 μmol/L、3 μmol/L及10 μmol/L组的最大尾电流分别为(55.9±3.8)pA/pF、(35.7±3.2)pA/pF及(15.5±1.4)pA/pF,均明显低于对照(0 μmol/L)组(P<0.05,各组n=9)。以上结果说明奎尼丁对hERG电流有明显的抑制。

图1 给予不同浓度奎尼丁hERG电流的激活电流和尾电流I-V曲线Figure 1 I-V relationships for amplitudes of activation currents and tail currents recorded during test pulses under different concentrations of quinidine

2.2 奎尼丁对hERG电流的慢性作用

HEK293细胞转染进质粒24 h后往培养基加入不同浓度的奎尼丁,继续培养24 h后立即洗脱奎尼丁后记录hERG电流。从图2A显示的是不同浓度的奎尼丁孵育HEK293细胞后记录的hERG电流图形。图2B显示的是激活电流的I-V曲线,可以看出各组细胞的最大激活电流的命令电压都是0 mV,但各组在不同命令电压下的激活电流密度无明显变化(P>0.05)。图2C显示的是尾电流的I-V曲线,各组在不同命令电压下的尾电流密度无明显变化(P>0.05)。

2.3 奎尼丁对hERG蛋白表达的影响

HEK293细胞转染进质粒后24 h时往培养基加入不同浓度的奎尼丁,继续培养24 h立即洗脱奎尼丁后进行Western blot检测hERG蛋白。运用Western blot技术发现hERG通道蛋白表现为两条带,135 kD为不完全糖基化的通道蛋白,滞留在胞质中;而155 kD为完全糖基化的通道蛋白,为转运到胞膜上的hERG通道蛋白。图3显示的是不同浓度奎尼丁孵育转染hERG质粒的细胞后检测到的hERG蛋白表达,从图中可看出,不同浓度奎尼丁下hERG蛋白表达无明显变化,说明奎尼丁对hERG蛋白的表达无明显影响。

3 讨论

奎尼丁是一种非选择性钠离子通道阻滞剂,为Ⅰa类抗心律失常药,由于其致心律失常作用已严重影响其在临床上的应用。本实验利用全细胞膜片钳及Western blot技术观察到:奎尼丁对hERG电流有明显的瞬时抑制作用,并表现为浓度依赖性;慢性作用下,奎尼丁对hERG电流及hERG通道蛋白无明显影响。

目前已经发现多种药物(常规抗心律失常药物、抗生素、抗组胺药物以及抗精神病药物等)可阻断hERG通道引起药物性长QT综合征,其主要机制之一是药物对hERG钾通道产生直接抑制作用[7,8]。奎尼丁是较早发现的引起QT间期延长的药物,可使2%-6%病人引起晕厥。奎尼丁不仅是钠通道阻断剂,研究发现其主要通过阻断快速激活延迟整流钾通道的α亚单位(hERG通道)引起QT间期延长,从而引起尖端扭转性室性心律失常等临床症状。本实验通过膜片钳亦证明了奎尼丁对hERG电流有明显的直接抑制作用,并呈现浓度依赖性。

图2 奎尼丁孵育24 h后hERG电流的激活电流和尾电流I-V曲线Figure 2 I-V relationships for amplitudes of activation currents and tail currents recorded during test pulses after cultured with quinidine for 24 h

图3 不同浓度奎尼丁孵育后hERG通道蛋白的表达Figure 3 Western blot analysis of hERG protein after treated with quinidine

hERG通道蛋白在内质网中初步合成和组装折叠后,在内质网中进行不完全糖基化。然后不完全糖基化的HERG蛋白被转运到高尔基体内进行完全糖基化。最终完全糖基化和正确折叠的HERG通道蛋白被转运到细胞膜上。运用Western blot技术发现hERG通道蛋白表现为两条带,135 kD为不完全糖基化的通道蛋白,而155 kD为完全糖基化的通道蛋白。近期研究显示药物性长QT综合征的机制不仅是药物对hERG通道有直接抑制作用,某些药物还对hERG通道蛋白的表达与转运有抑制作用[9,10]。三氧化二砷对hERG电流无直接抑制作用,而阻碍了hERG蛋白的转运表达,当三氧化二砷作为治疗血液系统疾病时,长期使用亦可引起长QT综合征。西沙比利及普罗布考不仅直接抑制hERG电流,还影响hERG蛋白的表达转运[11,12]。本实验用不同浓度的奎尼丁孵育表达hERG蛋白的HEK293细胞后,运用Western blot技术检测到hERG通道蛋白无明显变化。说明奎尼丁不影响hERG通道蛋白的表达转运。

综上所述,奎尼丁对hERG钾电流有直接抑制作用,但并不影响hERG通道蛋白的表达转运。其对hERG通道的直接阻断作用为奎尼丁引起长QT间期综合征的根本机制。

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Effects of quinidine on hERG potassium current and hERG channel protein in HEK293 cell line

HUO Jianhua1*,GUO Xueyan2,QIANG Hua1,LIU Ping1,BAI Ling1,MA Aiqun1

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofGastroenterology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital;*Correspondingauthor,E-mail:huojianhua2005@126.com)

ObjectiveTo explore the effect of quinidine on ether-a-go-go related gene(hERG)current and hERG channel protein and its possible mechanism of quinidine-induced long QT syndrome.MethodsHEK293 cells were transiently transfected with plasmid containing hERG gene via Lipofectamine.The hERG current was observed by whole-cell patch-clamping and the expression of hERG channel protein was detected by Western blot analysis.①HEK293 cells were transfected with plasmid,and after 48 h the cells were treated with different concentrations(0,1,3,10 μmol/L)of quinidine and patch clamp experiments were operated for instantaneous effect of quinidine.②HEK293 cells were transfected into plasmid for 24 h,then treated with different concentrations of quinidine(1,3,10 μmol/L)for 24 h,and then the patch clamp and Western blot were operated to observe the chronic effect of quinidine.ResultsAfter HEK293 cells were transfected into the plasmid for 48 h,the hERG current was significantly inhibited after treated with different concentrations of quinidine.The maximal density of tail currents were(55.9±3.8)pA/pF,(35.7±3.2)pA/pF and(15.5±1.4)pA/pF in 1 μmol/L,3 μmol/L and 10 μmol/L quinidine groups,respectively(P<0.05vs0 μmol/L).HEK293 cells were transfected into plasmid for 24 h and cultured with different concentrations of quinidine for 24 h,the hERG current showed no significant change.Western blot result showed that there was no significant change in the expression of hERG protein in HEK293 cells cultured with different concentrations of quinidine.ConclusionQuinidine shows an immediate and direct inhibitory effect on hERG potassium current,but it does not affect the expression of hERG channel protein.The direct inhibition of hERG channel is the basic mechanism of long QT syndrome caused by quinidine.

long QT syndrome； quinidine； hERG； HEK293

国家自然科学基金资助项目(30801133)；陕西省自然科学基础研究计划项目(2014JM2-8154)

霍建华,男,1979-03生,博士,主治医生,E-mail:huojianhua2005@126.com

2017-01-04

R541.7

A

1007-6611(2017)04-0301-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.001