脂肪源性神经干细胞细胞移植对帕金森病大鼠脑内氧化应激损伤的影响

高 华,毛洁萍,罗 琴,杨新玲

(1新疆医科大学第五附属医院神经内科,乌鲁木齐 830000;2乌鲁木齐市友谊医院神经内科;3新疆医科大学附属肿瘤医院综合内科;4新疆医科大学第二附属医院;*通讯作者,E-mail:poplar862@sohu.com)



脂肪源性神经干细胞细胞移植对帕金森病大鼠脑内氧化应激损伤的影响

高 华1,毛洁萍2,罗 琴3,杨新玲4*

(1新疆医科大学第五附属医院神经内科,乌鲁木齐 830000;2乌鲁木齐市友谊医院神经内科;3新疆医科大学附属肿瘤医院综合内科;4新疆医科大学第二附属医院;*通讯作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

目的 探讨脂肪源来源的神经干细胞细胞移植对帕金森病(Parkinson,s disease,PD)大鼠模型脑内氧化应激损伤的影响。 方法 获取SD大鼠脂肪干细胞,利用神经营养因子将其诱导为神经干细胞。用6羟基多巴胺(6-OHDA)大鼠纹状体内两点毁损法制作PD模型(旋转圈数>7 r/min),将成功大鼠模型随机分为模型组和神经干细胞移植组,每组15只,另选15只正常大鼠为对照组。纹状体区立体定位细胞移植后8周,进行模型组和细胞移植组大鼠旋转圈数的行为学检测。化学比色法分别检测PD模型组、神经干细胞移植组、正常对照组大鼠脑内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性以及丙二醛(MDA)含量。免疫组化法计数大鼠脑内酪氨酸羟化酶(TH)数量。 结果 细胞移植后8周,细胞移植组40 min内大鼠旋转圈数(19±4)较PD模型组旋转圈数(38±3)减少,大鼠脑内SOD、GSH、GSH-Px活性提高,MDA含量减少。TH计数表明,细胞移植组(22.40±3.89)、模型组(13.50±1.08)及正常对照组(43.20±3.32)三组比较差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 脂肪来源的神经干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠可改善其行为活动,其机制可能与减轻大鼠脑内6-OHDA所致的氧化应激损伤有关。

脂肪干细胞； 神经干细胞； 氧化应激； 帕金森病； 细胞移植

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种以静止性震颤、肌强直、运动减少及姿势步态异常等为主要临床表现的慢性退行性神经系统疾病。其病理特征主要为中脑黑质多巴胺神经元大量丧失及胶质细胞增生。既往研究认为氧化应激、线粒体功能障碍、泛素蛋白酶体系统(UPS)功能障碍、炎性反应、兴奋性氨基酸毒性和凋亡等都参与 PD 的发病过程[1]。某些基础及临床研究表明,帕金森病患者的机体处于氧化应激状态[2]。氧化应激作为帕金森病的发病机制之一,也被认为是致黑质DA 能神经元凋亡的可能因素之一[3]。干细胞以其多功能性,成为目前细胞移植治疗神经系统疾病的热点之一,如何选择合适正确的干细胞来源也成为讨论的重点。脂肪干细胞以易获得性、多分化性的特点日益受到关注。

本实验通过从SD大鼠脂肪中获取脂肪干细胞(adipose stem cell),经过体外培养,采用神经生长因子进一步将其诱导成为神经干细胞,将其移植治疗PD大鼠模型,观察大鼠行为学及脑内氧化应激的各指标的变化,探讨其保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

氯胺酮(福建古田药业有限公司)；Ⅰ型胶原酶(Worthington美国)；胰酶(Sigma)；低糖DMEM、 DMEM/F12培养基、B27(Gibco美国)；胎牛血清(杭州四季青)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),表皮生长因子(EGF) (Peprotech美国)；6羟基多巴胺(6-OHDA)，阿扑吗啡(APO)(Sigma美国)；超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒，丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.2 实验动物与分组

SPF级雄性SD大鼠,(110±10)g,新疆医科大学实验动物中心提供,经过动物实验医学伦理审核,伦审编号:A-20141008019,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。参照文献[4]的大鼠脑立体定位图谱,依据文献[5]在右侧黑质区和腹侧被盖区注射,采用两点单侧6-OHDA注射法制备 PD模型,造模1周后以腹腔注射APO(0.5 mg/kg),持续观察40 min,以恒定向左侧旋转并平均转速大于7 r/min视为成功PD模型。将造模成功大鼠随机分为模型组和神经干细胞移植组,每组15只。另选15只正常大鼠为对照组。

1.3 脂肪干细胞的培养、神经干细胞的诱导及细胞的移植

依据既往实验方法[6],腹腔注射氯胺酮(0.75 ml/100 g)麻醉SD大鼠,无菌取其腹股沟处脂肪,进行体外培养、纯化脂肪干细胞,传至第3代将其置于DMEM/F12+2% B27+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF的神经干细胞培养基中诱导分化为神经干细胞,以Nestin表达阳性为检测标准。将诱导的神经干细胞在脑立体定位下给予大鼠右侧纹状体两点移植:前囟后(0.2±0.1)mm,矢状缝右侧(2.5±0.1)mm,硬膜下(5.0±0.1)mm;前囟后(1.0±0.1)mm,矢状缝右侧(3.0±0.1)mm,硬膜下(5.5±0.1)mm。

1.4 细胞移植后各组大鼠的行为学检测

细胞移植后8周,在APO诱导下,分别检测脂肪源性神经干细胞移植组和单纯模型组大鼠的旋转圈数的变化。

1.5 检测脑组织匀浆氧化应激指标

大鼠的行为学检测结束后,将三组大鼠处死获取其纹状体区脑组织0.2 g低温状态下研磨并进行匀浆,将匀浆液以4 000 r/min,离心15 min,取其上清液用比色法测量MDA、SOD、GSH和GSH-Px。操作方法按照按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书步骤进行测试。

1.6 免疫组化染色计数TH

大鼠安乐死后取脑,4%多聚甲醛固定,脱水、包埋,常规行石蜡切片,片厚6 μm,取纹状体部分脑片行TH免疫组织化学染色。应用DAB试剂盒显色。每组各取2只大鼠,每只取5张纹状体区片,每张片取2个不同视野,计数TH阳性细胞数。

1.7 统计学分析

实验数据按完全随机对照设计的要求收集整理,所有数据以均数±标准差表示,全部数据采用SPSS17.0软件进行处理,两样本均数比较先进行方差齐性检验,如方差齐采用独立样本t检验,方差不齐采用t′检验。多个样本均数比较采用单因素方差分析,方差不齐采用近似F检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物行为学检测

细胞移植后8周,经APO诱导后,脂肪源性神经干细胞移植组与模型组比较,大鼠旋转圈数显著减少[(19±4)r/minvs(38±3)r/min],差异有统计学意义(P<0.05),行为学得到有效改善。

2.2 各组大鼠纹状体SOD、GSH、GSH-Px和MDA含量

细胞移植后8周,细胞移植组与正常组及模型组比较,脑内MDA含量有所下降,SOD、GSH和GSH-Px活性有所上升,但未能达到正常,三组间差异均有统计学意义(P<0.05,见表1)。

组别SOD(nU/ml)GSH(mg/g)GSH-Px(nU/g)MDA(nmol/mg)模型组99.17±4.235.22±0.441.96±0.147.27±0.30细胞移植组113.72±11.556.16±0.302.87±0.204.85±0.74正常对照组203.13±16.178.05±0.373.80±0.223.77±0.33 F345.34235.70348.84190.97 P0.000.000.000.00

2.3 各组大鼠黑质区TH计数

细胞移植后8周,脂肪源性神经干细胞移植组大鼠黑质区TH表达的数量较模型组有所增加,但少于正常对照组,三组间TH数量比较差异有统计学意义(P<0.05,见表2,图1)。

组别TH计数FP模型组13.50±1.08254.470.00细胞移植组22.40±3.89正常对照组43.20±3.32

图1 大鼠黑质区TH免疫组化染色 (×400)Figure 1 Immunohistochemical staining of TH in substantia nigra (×400)

3 讨论

PD病理主要为黑质纹状体DA能神经元缺失,目前研究表明氧化应激反应的增强也参与导致黑质细胞死亡过程[7,8]。正常情况下,黑质部位存在氧化和抗氧化之间的平衡,如SOD、GSH 的抗氧化保护系统发生异常,增强氧化应激反应,自由基生成过多,造成蛋白质及脂质过氧化损害,介导神经元的死亡[9，10]。许继平等[11]在研究中发现帕金森病患者中抗氧化酶活性降低,过氧化脂质代谢增强。任金鹏等[12]在采用百草枯建帕金森病模型,小鼠脑内其超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、过氧化物酶活性降低及丙二醛水平升高。证实氧化应激、自由基损伤在帕金森病发生中起到不可小觑的作用[13,14]。

SOD是一种自由基的清除剂。GSH-Px可特异催化还原型谷胱甘肽GSH对过氧化氢的还原反应,起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。MDA可以反应机体内脂质过氧化的强度,间接反应细胞损伤程度。

细胞移植治疗作为中枢神经系统疾病治疗的一种可行性方式,具有广泛前景,脂肪干细胞来源丰富,获取简单备受关注并且具有多种分化潜能[15，16]。本实验采用获取脂肪干细胞,在利用神经营养因子诱导成为神经干细胞移植治疗帕金森模型鼠,这在前期实验中已经实施并成功[17]。

本次实验结果表明,PD模型组中SOD、GSH-Px、GSH的含量下降,MDA含量则升高明显。提示帕金森病大鼠脑内的氧化反应被激活,多巴胺能神经元抗氧化应激损伤的水平下降,机体脂质过氧化反应增强,处于一种氧化应激状态。这从一定程度上反映模型符合帕金森病氧化应激的发病机制,这也与陆明佳等[18，19]的研究结果一样。在细胞移植后8周,脂肪源性神经干细胞移植的PD大鼠的旋转行为有明显改善,这也与既往研究结果一致[17]。细胞移植后8周脂肪源性神经干细胞移植组的MDA的含量较单纯PD模型组的有所下降,但不能达到正常水平。而相应状态下移植组大鼠脑内SOD、GSH-Px、GSH含量较模型组略有增加。大鼠黑质区TH计数结果说明,在经过细胞移植后可以提高TH数量,这也与其在APO诱导下旋转圈数减少的行为学结果相一致,但不能促使其恢复正常功能状态。提示脂肪源性的神经干细胞细胞移植治疗后可以提高机体的抗氧化能力和清除自由基损伤的能力,从而可能在一定程度上保护了多巴胺能神经元[20，21],但其与帕金森病的其他发病机制,如线粒体功能异常、炎症、细胞毒性间的相互关联性仍然不清楚,需要进一步做有关相关通路的深入研究和探讨。

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Effects of adipose-derived neural stem cell transplantation on oxidative stress reaction in rats with Parkinsons disease

GAO Hua1,MAO Jieping2,LUO Qin3,YANG Xinling4*

(1DepartmentofNeurology,FifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2DepartmentofNeurology,UrumqiFriendshipHospital;3DepartmentofGeneralMedicine,AffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity;4SecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:poplar862@sohu.com)

ObjectiveTo explore the effects of adipose-derived neural stem cell transplantation on oxidative stress reaction in rats with Parkinson’s disease (PD).MethodsThe adipose stem cells from SD rat fat tissues were isolated and induced to develop the neural stem cell with neurotrophic factors.Meanwhile,the PD model was established through brain stereotoxic injection of 6-OHDA(7 r/min).The PD model rats were randomly divided into two groups:model group(n=15) and neural stem cell transplantation group(n=15).Fifteen normal SD rats were chosen as normal group.The behavior(number of rotation) was observed in model group and cell transplantation group at 8 week.Moreover,the contents of superoxidedismutase(SOD) and glutathione(GSH),the activity of glutathione peroxidase(GSH·Px) and malondialdehyde(MDA) in rat brain nigrostriatum were detected by chemical colorimetry.The number of TH in striatum was detected by immunohistochemical staining.ResultsAt 8 week,the rotation in 40 min was lower in neural stem cell transplantation group than in model group (19±4vs38±3,P<0.05).The contents of SOD,GSH,GSH-PX were increased compared with PD model group and normal group,while the content of MDA was decreased significantly.The quantity of TH were 22.40±3.89 in cell transplantation group,13.50±1.08 in model group,and 43.20±3.32 in normal group,and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe adipose-derived neural stem cell transplantation can improve the behavior of PD rats,which may be related to the decrease of the injury of oxidative stress.

adipose stem cell; neural stem cell; oxidative stress; Parkinson’s disease; cell transplantation

新疆维吾尔自治区科技支疆基金资助项目(201501160)

高华,女,1979-08生,在读博士,主治医师,E-mail:gaohuasnow@163.com

2016-12-19

R742

A

1007-6611(2017)04-0333-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.007