响应面法优化柑橘黄豆酱的制曲工艺

彭铭烨，周梦舟，付彩霞，李冬生，徐宁*

(1.湖北工业大学工业发酵湖北省协同创新中心 湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068；2.湖北土老憨调味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

响应面法优化柑橘黄豆酱的制曲工艺

彭铭烨1，周梦舟1，付彩霞2，李冬生1，徐宁1*

(1.湖北工业大学工业发酵湖北省协同创新中心 湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068；2.湖北土老憨调味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

以优化柑橘黄豆酱的制曲工艺为目标，选取橘粉添加量、菌种复配比、制曲时间为影响因素，采用成曲中总黄酮含量为指标进行研究。在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken中心组合设计原理和响应面法，建立回归方程预测模型，得到最优的制曲条件：橘粉添加量10%，菌种复配比3∶1，制曲时间44 h。该条件下测得成曲中总黄酮含量为0.4 mg RE/g，与理论值的相对误差只有0.5%。

柑橘粉；米曲霉；黑曲霉；制曲；总黄酮

豆酱又称大豆酱、豆酱，是指利用米曲霉等微生物发酵黄豆而制成的酱制品，是我国传统的发酵调味品[1]。

而制曲是黄豆酱制作的一个关键过程，成曲的好坏会直接影响黄豆酱的品质。在黄豆酱制曲过程中，诸多因素会对成曲的质量造成影响，比如原料的配比、菌种的接种量、菌种的复配比以及制曲的时间等均会影响成曲的品质。

柑橘是我国南方主要的水果之一，由于色、香、味兼备，爽口清香，甜爽多汁，风味醇厚，营养丰富，深受人们喜爱[2]。但是柑橘生产加工过程中伴随大约30%的皮等副产物的生成，大部分都被直接作为生活垃圾处理，对环境造成严重污染[3]。而柑橘皮中含有大量生物活性物质，这些物质不仅可以抗炎[4-7]，还可以降血脂[8,9]和调节新陈代谢[10-13]。因此，本研究根据影响酱油制曲的主要因素进行试验，在单因素试验的基础上，以成曲中总黄酮的含量为响应值进行响应面试验，得到柑橘曲料制备的最优工艺，为制备高抗氧化活性的保健曲料提供理论性参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜柑橘皮 湖北土老憨生态农业集团；大豆、面粉 市售；米曲霉AS 3.951(沪酿 3.042) 湖北省食品发酵工程技术研究中心。

氢氧化钠、亚硝酸钠、氯化铝、甲醇 国药集团化学试剂有限公司；芦丁(99%) 阿拉丁试剂(上海)有限公司。

1.2 仪器与设备

MJX-280HM菌培养箱 宁波莱福科技有限公司；WFJ2000紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；YXQ-SG41-280-B高压蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂；Biosafer-10D 台式冻干机 赛飞(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 制备橘粉

将新鲜的柑橘皮于-18 ℃下冷冻48 h，然后将柑橘皮置于冷冻干燥机托盘上，冷冻干燥24 h，最后将干燥后的柑橘皮进行粉碎并通过120目的网筛，得到橘粉。

1.3.2 工艺流程

橘粉 种曲(米曲霉和黑曲霉)

↓ ↓

黄豆 → 润水 → 蒸煮 → 冷却 → 面粉→ 接种 → 制曲 → 成曲。

1.3.3 制曲

曲料配方：黄豆∶面粉为7∶3(m/m)，实验组采用橘粉替代部分面粉。黄豆经浸泡后，121 ℃蒸压20 min，冷却后拌入面粉并接入种曲0.3% (m/m)，拌匀。制曲室34 ℃培养10～12 h，松曲1次。接着控温32～35 ℃，19～22 h第2次松曲。最后调节培养温度28～30 ℃，保持该温度至制曲结束。

1.3.4 单因素试验

选取橘粉添加量、菌种复配比和制曲时间3个因素，依据表1中的因素水平和试验条件采用1.3.3的方法制备曲料，然后检测成曲中总黄酮的含量，考察以上因素对成曲中总黄酮含量的影响，每个试验重复3次，取平均值。

表1 单因素试验条件Table 1 Factors and levels of single factor experiment

1.3.5 制曲工艺最优参数的确定

在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken试验设计原理[14]，设计三因素三水平响应面分析试验，其因素与水平见表2。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface test

1.3.6 总黄酮的提取及含量测定

总黄酮的提取方法参考Xu等[15]的报道，称取10 g冷冻干燥的成曲样品，溶于100 mL 80% (V/V) 甲醇溶液中并于室温下超声15 min，10000 r/min离心10 min。残余物继续用上述方法提取，共提取3次，合并3次离心所得的上清液，该溶液用于测定总黄酮的含量。

总黄酮的含量测定方法参考黄健蓉等[16]的报道，即1 mL上清液用去离子水稀释至5 mL，然后向溶液中加入0.3 mL 5% (m/V) NaNO2溶液。5 min后，加入0.3 mL 10% (m/V) Al(NO3)3溶液，放置6 min后，继续添加2 mL 1 mol/L NaOH，然后用去离子水定容到10 mL。在510 nm条件下使用紫外可见分光光度计测定各个组分的吸光值，空白对照为未添加样品的溶液和水混合体系。选取0，0.1，0.2，0.3,0.4，0.5, 0.6 mg/mL的芦丁来绘制相应的标准曲线。总黄酮含量用芦丁当量RE/g表示，每个平行重复3次实验。

1.4 数据分析

实验数据用Design Expert 8.0.5b，Excel 2013及SPSS软件处理，差异显著性水平P<0.05，平均数之间的比较采用极差检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 橘粉添加量对成曲中总黄酮含量的影响

图1 橘粉添加量对成曲中总黄酮含量的影响

注：小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，空白表示只接种米曲霉制曲，下同。

据分析，柑橘皮中除了含有纤维素、木质素以及丰富的微量元素外，还含有大量的黄酮类物质，而黄酮类物质具有较强的抗氧化活性[17]。制曲中橘粉的加入不仅可以提高成曲的品质，还可以增加其风味和保健功效。Xu等研究发现市售酱制品中总黄酮的含量范围在0.17～1.23 mg RE/g。

由图1可知，在橘粉添加量为10%时，成曲中总黄酮的含量最高，可达到0.4 mg RE/g，与对照组相比提高了15%。但当橘粉添加量为15%时，成曲中总黄酮比对照组降低了20%。由此可知，橘粉加入量过大会抑制微生物的生长，从而影响蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等各种酶的分泌，造成成曲中黄酮类物质含量降低。故选定橘粉添加量为3%，7%和10%进行响应面优化试验。

2.1.2 菌种复配比对成曲中总黄酮含量的影响

图2 菌种复配比对成曲中总黄酮含量的影响

多菌种耦合制曲不仅可以弥补米曲霉单菌种制曲存在的酶系不足、成曲品质一般、抗氧化活性物质低等缺陷，还丰富了发酵的酶系，提高了成曲中总黄酮含量，对成曲品质的提高有积极意义。

由图2可知，当米曲霉与黑曲霉的比例为2∶1接种制曲时，成曲中总黄酮的含量为0.26 mg RE/g，与对照组相比减少了24%。而随着黑曲霉所占比例不断降低，成曲中总黄酮的含量不降反增，在米曲霉与黑曲霉的比例为3∶1时可使成曲中总黄酮的含量达到最大。故选取菌种复配比为3∶1，4∶1和5∶1进行响应面优化试验。

2.1.3 制曲时间对成曲中总黄酮含量的影响

图3 制曲时间对成曲中总黄酮含量的影响

在制曲过程中，菌种需要一定时间的萌发，从而才能在培养基中生长出孢子和菌丝，制曲时间过短，会导致菌丝生成不足，总黄酮含量较低，影响成曲的品质；而制曲时间过长，可能会滋生更多的杂菌，导致成曲质量降低。

由图3可知，当制曲时间为36 h时，成曲中总黄酮的含量为0.26 mg RE/g，与对照组相比减少了23%。而随着制曲时间的不断延长，成曲中总黄酮的含量也呈现先增后减的趋势。在制曲时间为44 h时成曲中总黄酮的含量达到最大，其总黄酮的含量为0.4 mg RE/g。故选定制曲时间为40,44,48 h进行响应面优化试验。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验方案及结果

在单因素试验的基础上，选取橘粉添加量、菌种复配比、制曲时间3个因素为自变量，以成曲中总黄酮的含量为响应值，采用Box-Benhnken设计进行响应面试验，试验结果见表3。

表3 响应面分析试验设计方案及结果Table 3 Experimental design and results of response surface analysis

通过 Design Expert 8.0.5b软件中的Box-Benhnken Design模型对表3中数据进行二次响应面回归拟合，得到成曲中总黄酮的含量与3个因素之间的回归方程：Y=0.36+0.014A-3.75×10-3B+7.5×10-3C-0.01AB+7.5×10-3AC+2.5×10-3BC+6×10-3A2+1×10-3B2-1.5×10-3C2，对模型进行方差分析及回归系数显著性检验，结果见表4。

表4 回归分析结果Table 4 Results of regression analysis

注：“*”表示差异显著，P<0.05；“**”表示差异极显著，P<0.01。

由表4回归方差分析显著性检验可知，该模型回归显著(P<0.05)，失拟项不显著，说明该模型与实际实验拟合较好，故响应面方法对柑橘曲料的制备工艺的优化合理可行。

根据表4中：F(A)=26.14，F(B)=1.94，F(C)=7.78可知，各因素条件对成曲品质的影响程度大小顺序为：橘粉添加量>制曲时间>菌种复配比。根据显著性结果可知，回归方程一次项A极显著，一次项C和交叉项AB显著，其他均不显著。

2.2.2 响应面结果优化与分析

根据Design Expert 8.0.5b软件，做出各因素对成曲中总黄酮含量的响应面分析图，考察所拟合的响应面形状，分析橘粉添加量、菌种复配比、制曲时间对总黄酮含量的影响，其响应面结果见图4～图6。

图4 橘粉添加量和菌种复配比对成曲中总黄酮含量影响的响应面图

图5 橘粉添加量和制曲时间对成曲中总黄酮含量影响的响应面图

图6 菌种复配比和制曲时间对成曲中总黄酮含量影响的响应面图

依据Design Expert 8.0.5b软件对响应面试验进行优化分析，得到最佳工艺条件：橘粉添加量为9.94%，菌种复配比为3.06∶1，制曲时间为44.6 h，总黄酮含量的理论值为0.402 mg RE/g。考虑实际操作条件，将上述最佳发酵条件修正为：橘粉添加量10%，菌种复配比3∶1，制曲时间44 h。该条件下平行3次测得成曲中总黄酮含量为0.4 mg RE/g，相对误差为0.5%，说明回归方程与实际情况拟合较好。

3 结论

在单因素试验基础上，利用响应面法，结合Box-Benhnken Design模型的分析，对柑橘黄豆酱制曲工艺进行了优化，进一步得到最优的工艺条件：橘粉添加量为10%，菌种复配比为3∶1，制曲时间为44 h。该条件下测得成曲中总黄酮含量为0.4 mg RE/g，相对误差为0.5%。利用柑橘皮制备黄豆酱的曲料，该曲料不仅具有显著的柑橘风味，还可以提高曲料中总黄酮的含量，使该曲料的品质得到提升，同时增加黄豆酱的保健功效和提高柑橘皮的附加值。

[1]沈宪良.黄豆酱技术工艺概述[J].食品研究与开发,2012,33(7):238-240.

[2]吴安龙.浅谈柑橘高产栽培技术[J].吉林农业,2012(12):96.

[3]关海宁,刁小琴,张润光.柑橘皮功能性成分研究现状及发展前景[J].食品研究与开发,2008,29(9):169-173.

[4]Gosslau A,Chen K Y,Ho C T,et al.Anti-inflammatory effects of characterized orange peel extracts enriched with bioactive polymethoxyflavones[J].Food Science & Human Wellness,2014,3(1):26-35.

[5]Li S,Wang H,Guo L,et al.Chemistry and bioactivity of nobiletin and its metabolites[J].Journal of Functional Foods,2014,6(1):2-10.

[6]Gosslau A,Li S,Ho C T,et al.The importance of natural product characterization in studies of their anti-inflammatory activity[J].Molecular Nutrition & Food Research,2011,55(1):74-82.

[7]Li S,Lin Y C,Ho C T,et al.Formulated extract from multiple citrus peels impairs dendritic cell functions and attenuates allergic contact hypersensitivity[J].International Immunopharmacology,2014,20(1):12-23.

[8]Kou M C,Fu S H,Yen J H,et al.Effects of citrus flavonoids,5-hydroxy-3,6,7,8,3 prime,4 prime-hexamethoxyflavone and 3,5,6,7,8,3 prime,4 prime-heptamethoxyflavone,on the activities of macrophage scavenger receptors and the hepatic LDL receptor[J].Food & Function,2013(4):602-609.

[9]Kurowska E M,Manthey J A.Hypolipidemic effects and absorption of citrus polymethoxylated flavones in hamsters with diet-induced hypercholesterolemia[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2004,52(10):2879-2886.

[10]Gorinstein S,Caspi A,Libman I,et al.Red grapefruit positively influences serum triglyceride level in patients suffering from coronary atherosclerosis: studies in vitro and in humans[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2006,54(5):1887-1892.

[11]Assini J M,Mulvihill E E,Huff M W.Citrus flavonoids and lipid metabolism[J].Current Opinion in Lipidology,2012,24(1):34-40.

[12]Chanet A,Milenkovic D,Manach C,et al.Citrus flavanones: what is their role in cardiovascular protection?[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2012,60(36):8809-8822.

[13]Parkar N,Addepalli V.Nobiletin ameliorates streptozotocin induced diabetic retinopathy in experimental rats[J].Phytomedicine,2014(1):3-7.

[14]徐向宏，何明珠.试验设计与Design Expert、SPSS应用[M].北京:科学出版社，2010.

[15]Xu L,Du B,Xu B.A systematic,comparative study on the beneficial health components and antioxidant activities of commercially fermented soy products marketed in China[J].Food Chemistry,2015,174(3):202-213.

[16]黄健蓉，王志江，徐金瑞，等.柑橘总黄酮检测方法研究[J].饮料工业,2013,26(5):42-44.

[17]臧玉红.柑橘皮的综合利用[J].食品与发酵工业,2005,31(7):145-146.

Optimization of Koji-making Process of Citrus Soybean Paste by Response Surface Methodology

PENG Ming-ye1, ZHOU Meng-zhou1, FU Cai-xia2, LI Dong-sheng1, XU Ning1*

(1.Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei Province,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China；2.Hubei Tulaohan Flavouring and Food Co.,Ltd., Yichang 443000, China)

The objectives of this study are to optimize the koji-making process of citrus soybean paste with combination of one-factor-at-a-time method(OFAT) and response surface methodology(RSM)．The influence factors are additive amount of citrus powder, strain multiplexing ratio and koji-making time.The index is the content of total flavonoids in finished koji. The single factor experiment is used to set up the simulated quadratic polynomial regression equation of prediction model about influence factors and index value by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory. The results show that the optimum koji-making conditions are as follows: the additive amount of citrus powder is 10%, the ratio ofAspergillusoryzaeandAspergillusnigeris 3 and the koji-making time is 44 h. Under such conditions，the content of total flavonoids is 0.4 mg RE/g in finished koji, and the relative error with theoretical value is only 0.5%.

citrus powder；Aspergillusoryzae；Aspergillusniger；koji making；total flavonoids

2017-02-10 *通讯作者

湖北省自然基金(2015CFB679)；湖北省科技厅项目(2015BCE028)

彭铭烨(1992-)，男，江西宜春人，硕士，研究方向：食品科学； 徐宁(1979-)，男，陕西渭南人，副教授，博士，研究方向：发酵食品。

TS264.24

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.002

1000-9973(2017)07-0006-05