恐伤孕鼠所产80日龄仔鼠情志与海马区去甲肾上腺素和肾上腺素水平的相关性研究

李新民，杨丽萍，万海娇，朱江慧，侯俊林，詹向红



·论著·

恐伤孕鼠所产80日龄仔鼠情志与海马区去甲肾上腺素和肾上腺素水平的相关性研究

李新民，杨丽萍*，万海娇，朱江慧，侯俊林，詹向红

目的 探讨妊娠期恐伤刺激对其80日龄仔鼠情志和海马区去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(EP)的影响，并探讨两者的相关性。方法 2015年1月—2016年3月，选取80日龄SPF级Wistar大鼠59只(雌鼠34只，雄鼠25只)，采用Morris水迷宫实验评价其认知水平。选取认知基线水平一致的30只雌鼠按照随机数字表法分为模型组和对照组，各15只，另选取认知基线水平一致且体格较强壮的15只雄鼠作为交配鼠。剩余雄鼠均作电击鼠用，剩余雌鼠备用代替不孕鼠。运用旁观电击法建立妊娠期恐伤大鼠动物模型。仔鼠延续母鼠分组，至80日龄时采用随机数字表法选取15只进行实验。采用旷场实验、糖水偏好实验、悬尾实验评价仔鼠情志；通过脑立体定位仪在右侧海马区采集脑透析液，应用高效液相色谱-电子俘获检测(HPLC-ECD)法检测NE和EP水平。结果 模型组旷场实验水平得分、垂直得分，糖水偏好实验糖水消耗量、糖水偏好值均低于对照组，悬尾实验静止不动时间长于对照组(P<0.05)。模型组各灌流时间点海马组织NE、EP水平均低于对照组(P<0.05)。仔鼠海马组织NE水平与旷场实验水平得分、垂直得分以及糖水偏好实验糖水偏好值呈正相关,与悬尾实验静止不动时间呈负相关(P<0.05)。仔鼠海马组织EP水平与旷场实验水平得分以及糖水偏好实验糖水偏好值呈正相关,与悬尾实验静止不动时间呈负相关(P<0.05)。结论 恐伤孕鼠可改变其80日龄仔鼠的情志及海马区NE和EP的水平，其情志改变与海马区NE和EP的水平密切相关。

精神障碍；妊娠；去甲肾上腺素；肾上腺素；情志

李新民，杨丽萍 ，万海娇，等.恐伤孕鼠所产80日龄仔鼠情志与海马区去甲肾上腺素和肾上腺素水平的相关性研究[J].中国全科医学，2017，20(23)：2875-2878.[www.chinagp.net]

LI X M,YANG L P,WAN H J,et al.Correlation of emotional changes with norepinephrine and epinephrine in the hippocampus of 80-day-old neonatal rats of fear-impaired pregnant rats[J].Chinese General Practice，2017，20(23)：2875-2878.

去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(EP)的涌现以及恐惧、愤怒情绪可作为精神异常的标志[1]，在应激状态下，肾上腺中NE和EP水平发生改变，说明应激过程中有下丘脑-垂体-肾上腺系统的参与[2]，可见精神异常与NE、EP水平紧密相关。而这种紧密的联系是否能够进行母子传递，依然是尚需解决的问题。本研究应用微透析技术考察恐伤孕鼠所产80日龄仔鼠海马区NE和EP水平，以揭示其与仔鼠情绪异常的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物 2015年1月—2016年3月，选取80日龄SPF级Wistar大鼠59只，其中雌鼠34只，体质量220～250 g；雄鼠25只，体质量250～290 g。Wistar大鼠均由山东鲁抗公司提供，实验动物合格证编号SCXK(鲁)20140001。本研究获得河南中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型建立 采用Morris水迷宫实验评价大鼠认知水平，选取基线水平一致的雌鼠按照随机数字表法分为模型组和对照组，各15只，另选取基线认知水平一致且体格较强壮的15只雄鼠作为交配鼠。剩余雄鼠均作电击鼠用，剩余雌鼠备用代替不孕鼠。

采用旁观电击法建立孕期恐伤大鼠动物模型[3]。自制交流箱参照Communication Box System改进，由45 cm×45 cm×30 cm有机玻璃组成，室内采用有机玻璃板分为9个15 cm×15 cm×30 cm小室，小室之间有机玻璃板上有若干直径为1 cm小孔，既可供旁观鼠逃避电击攀爬，又可使旁观鼠通过视觉、听觉、嗅觉获得临近大鼠的恐惧信息。底部由直径3 mm、间隔11 mm的不锈钢丝组成，可以连接调压器给予大鼠足底电击。放置电击鼠的中央小室及四角小室15 cm高处加隔板进行束缚，使其不能逃避足底电击，而放置旁观鼠的其余4个小室不加隔板。

模型制备方法：自造模第1天9：00将电击鼠和旁观鼠放入自制交流箱相应的小室内，秒表定时165 s，结束后鸣响15 s，鸣响时段给予瞬时25～35 V电刺激6～8次，重复10次/d,持续至孕第19天。旁观鼠可通过攀爬逃避电击，电击鼠却因受到上部隔板的束缚遭受电击而表现为尖叫、跳跃、大小便失禁，从而使旁观鼠通过视觉、听觉、嗅觉产生恐惧的心理反应。

各组雌鼠从电击第15 d起9：00按雌雄2∶1合笼，次日7：00检查受孕情况。雌鼠阴道口内有乳白色的阴栓，即可判定为受孕，记为孕第1天，如未发现阴栓可采用阴道涂片法进一步检测。仔鼠延续母鼠分组，按随机数字表法从出生的仔鼠中每窝抽取5只继续饲养，至80日龄时再按随机数字表法各抽取15只进行实验。

1.2.2 旷场实验 敞箱箱体为100 cm×100 cm×50 cm规格，周壁为黑色，底面由白色粉笔将其等分为25个方块。每只仔鼠观察5 min，经过底面方格为水平运动，以四只爪均进入该方格为标准，记1分；直立次数为垂直运动，以两只前爪全部离地为标准，记1分；记录仔鼠旷场实验期间的清洁次数与大便粒数。

1.2.3 糖水偏好实验 实验前先让仔鼠适应蔗糖水，第1个24 h给予仔鼠两瓶1%庶糖水，第2个24 h给予仔鼠1瓶纯水和1瓶含1%蔗糖水，每12 h将蔗糖水和纯水互换位置，以免由于动物习惯性行为对实验结果造成影响。禁食禁水12 h，每笼1只仔鼠，放置两瓶已经称重的水(1瓶纯水，1瓶1%蔗糖水)，测量1 h内仔鼠饮糖水量及糖水偏好情况，糖水偏好值=糖水消耗量/总液体消耗量×100%。

1.2.4 悬尾实验 采用自制悬尾实验操作箱体，用绳子在距离尾尖部4 cm处系住，头部离箱体底部约6 cm。将仔鼠悬挂2 min后开始观察，持续观察4 min，记录静止不动时间，即悬挂时停止挣扎，或仅有细小肢体动作的时间。

1.2.5 海马区NE和EP水平检测 麻醉仔鼠，头部剃除毛发后，固定在脑立体定位仪上，定位仔鼠右侧海马区，选取的坐标分别为A：-2.8 mm，L：+3.0 mm，V：3.4 mm；A：-5.2 mm，L：+5.0 mm，V：6.5 mm，植入套管、探针，微量注射泵设定流速为1.5 μl/min，透析液收集到自动采样器的一次性EP管内，自动采样器温度设置为4 ℃，自灌流80 min后每20 min收集一管，共6管。收集完毕直接用高效液相色谱-电子俘获检测(HPLC-ECD)法(ultimate3000高效液相系统，厂商：Thermo scientific；6041RS电化学检测器安培池，厂商：Thermo scientific)进行检测，若未及时检测放入-80 ℃冰箱内保存。

精密称取NE和EP各0.5 mg，置于10 ml定量瓶中，用林格液定容至10 ml制成母液，将母液分别稀释并混合，最后制成浓度为100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 ng/ml的梯度混合对照品液，置于-80 ℃冰箱保存。

色谱条件：流动相A为磷酸二氢钠100 mmol/L，枸橼酸钠50 mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA) 50 μmol/L，辛烷磺酸钠1.7 mmol/L，氯化钾2 mmol/L，流动相B为乙腈，A∶B=90∶10。设定流动相流速为0.125 ml/min，柱温30 ℃。电化学检测器应用玻碳工作电极，工作电压为520 mV，增益为10 nA，进样量为20 μl。

2 结果

2.1 旷场实验 两组清洁次数、大便粒数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组水平得分、垂直得分均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 两组仔鼠旷场实验结果比较

2.2 糖水偏好实验 模型组糖水消耗量、糖水偏好值均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3 悬尾实验 对照组与模型组仔鼠悬尾实验静止不动时间分别为(117.6±17.1)、(161.8±30.9)s，差异有统计学意义(t=4.849，P<0.05)。

Table 2 Comparison of sucrose preference test in two groups of neonatal rats

组别例数糖水消耗量(g)糖水偏好值(%)对照组157.4±1.377.4±7.3模型组154.4±1.153.2±9.6t值6.9527.739P值<0.001<0.001

2.4 NE水平 模型组各灌流时间点海马组织NE水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table 3 Comparison of NE levels in the hippocampal tissue of two groups of neonatal rats at different perfusion time points

组别例数80min100min120min140min160min180min对照组1514.49±3.8815.09±3.1915.29±2.8616.18±4.0316.60±3.0316.58±3.03模型组157.10±3.026.97±3.187.36±3.227.42±3.157.17±3.277.62±3.62t值5.8216.9827.1316.6338.1937.351P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.5 EP水平 模型组各灌流时间点海马组织EP水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。

Table 4 Comparison of EP levels in the hippocampal tissue of two groups of neonatal rats at different perfusion time points

组别例数80min100min120min140min160min180min对照组1513.58±3.8513.88±3.9414.18±3.8813.84±4.4813.90±4.3013.74±4.22模型组154.53±2.414.23±2.084.47±2.264.50±2.394.41±2.284.09±2.36t值7.7178.3898.3757.1247.5527.730P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.6 相关性分析 仔鼠海马组织NE水平与旷场实验水平得分、垂直得分以及糖水偏好实验糖水偏好值呈正相关,与悬尾实验静止不动时间呈负相关(P<0.05)。仔鼠海马组织EP水平与旷场实验水平得分以及糖水偏好实验糖水偏好值呈正相关,与悬尾实验静止不动时间呈负相关(P<0.05，见表5)。

3 讨论

本研究采用旷场实验评价仔鼠在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度，模型组水平得分、垂直得分均降低，自主探究行为减少，紧张增加；模型组仔鼠糖水消耗量减少、糖水偏好值降低，反映其快感缺失；模型组仔鼠悬尾实验静止不动时间延长，提示妊娠期惊恐刺激可导致仔鼠在成长过程中出现绝望状态。行为学实验结果提示，妊娠期惊恐刺激对子代的情志有确切的不良影响，且影响较为持久，而这种母子间的情志传代，与既往研究结果一致[4]。

表5 仔鼠行为学实验结果与海马组织NE、EP水平的相关性分析

Table 5 Correlation analysis of behavioral experimental results and levels of NE and EP in the hippocampus of neonatal rats

行为学实验NEEPr值P值r值P值旷场实验 水平得分0.4190.0210.4010.028 垂直得分0.3760.0410.3550.054糖水偏好实验 糖水偏好值0.705<0.0010.726<0.001悬尾实验 静止不动时间-0.5060.004-0.5410.002

注：NE=去甲肾上腺素，EP=肾上腺素

孕母和胎儿无直接神经联系，母体在应激状态下肾上腺皮质产生NE和EP[5]，而从母体循环到胎儿大脑的应激激素主要是肾上腺皮质激素[6]。孕母妊娠期受应激干预，可引起新生儿行为神经评分显著降低，脐带血促肾上腺皮质激素、NE和EP水平升高[7]。而这与胎盘NE转运蛋白清除NE的能力降低有一定的关系[8]。此为胎儿期和新生儿期血中应激激素NE和EP的水平变化提供有力依据。

本研究追踪恐伤孕鼠子代远期海马区应激激素NE和EP水平，以期找到其与情志异常的关系。海马区是调节焦虑、抑郁情绪的重要结构，是应激效应和高水平皮质激素最易损伤的部位，海马区分泌NE和EP的减少导致了模型组仔鼠情志和认知的发育障碍。恐伤孕鼠对子代海马区NE和EP水平的影响以及与情志异常的相关性，与慢性应激大鼠所致子代海马区NE和EP水平的异常以及其与情志异常的相关性，具有高度一致性[9]。亦有研究表明，妊娠应激母鼠所产仔鼠在青春期前卵巢NE水平降低，可能是由于交感神经发育低下，以代偿母代妊娠应激反应长期增加NE水平，延缓大鼠繁殖能力，这一机制可部分解释恐伤孕鼠NE和EP水平降低的发生原因，也是情志异常发生的物质基础[10]。

本研究阐明了恐伤孕鼠所产80日龄仔鼠情志与海马区NE和EP水平的密切相关，但其进一步的分子生物学机制尚需进一步研究。

作者贡献：杨丽萍、詹向红进行文章的构思与设计；李新民、杨丽萍进行研究的实施与可行性分析，对文章整体负责，并监督管理；万海娇、朱江慧进行数据收集；万海娇进行数据整理、统计学分析；李新民进行结果的分析与解释、论文撰写和修订；侯俊林负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：吴立波)

Correlation of Emotional Changes with Norepinephrine and Epinephrine in the Hippocampus of 80-day-old Neonatal Rats of Fear-impaired Pregnant Rats

LIXin-min,YANGLi-ping*,WANHai-jiao,ZHUJiang-hui,HOUJun-lin,ZHANXiang-hong

DepartmentofIntegratedChineseandWesternBasicMedicine,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046，China

*Correspondingauthor：YANGLi-ping，Professor；E-mail：bioylp@126.com

Objective To investigate the status of emotion and norepinephrine (NE) and epinephrine(EP) in the hippocampus of 80-day-old neonatal rats of fear-impaired pregnant rats,and to study the correlation of emotional changes with NE and EP.Methods This study was conducted from January 2015 to March 2016.Fifty-nine 80-day-old SPF Wistar rats(34 females and 25 males) were selected, and Morris water maze test was used to evaluate the cognitive level.Of them,30 females with the same cognitive level were selected and divided into the model group and control group by the random number table with 15 in each,15 strong males with the same cognitive level were selected as mating rats.The other male rats

electric shocks, while the other female rats were reserved to replace sterile rats.Fear-impaired pregnant rats were established by watching other rats being shocked by electricity.The neonatal rats were divided by the same method used by the fear-impaired pregnant rats and 15 of them were randomly selected for experiment on the 80th day after birth.Emotional changes in them were observed by open field test,sucrose preference test and tail suspension test.Brain microdialysis of the right hippocampus was collected with the stereotaxis instrument to determine the level of NE and EP by HPLC-ECD.Results Compared with the control group,the scores of horizontal and vertical movements,consumption of sucrose and sucrose preference value of the 80-day-old rats in the model group were decreased,while the immobility time was increased (P<0.05); levels of NE and EP in the hippocampus of 80-day-old rats in the model group were decreased at different liquid perfusion time points (P<0.05).The level of NE in the hippocampus of the 80-day-old rats presented a positive correlation with the scores of horizontal and vertical movements,and sucrose preference value,while it showed a negative correlation with the immobility time (P< 0.05).The level of EP in the hippocampus of the 80-day-old rats was positively correlated with the score of horizontal and vertical movements and sucrose preference value,while it was negatively correlated with the immobility time (P<0.05).Conclusion Fear-impaired pregnant rats change the emotion,and influence the level of NE and EP in the hippocampus in 80-day-old neonatal rats,and the emotional changes are closely related with NE and EP in the hippocampus.

Mental disorders；Pregnancy；Norepinephrine；Epinephrine；Emotion

国家自然科学基金面上项目(81373790)

R 74

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.y40

2016-12-18；

2017-06-14)

450046河南省郑州市，河南中医药大学中西医结合基础学科

*通信作者：杨丽萍，教授；E-mail： bioylp@126.com