Galectin-3在缺血性心功能不全家兔心室重构中的作用

张跃华， 李树仁， 邓文浩， 郝 潇， 李 沙， 马玉龙， 杨玲玲

(河北医科大学附属河北省人民医院心内一科， 河北 石家庄 050051)

Galectin-3在缺血性心功能不全家兔心室重构中的作用

张跃华， 李树仁△， 邓文浩， 郝 潇， 李 沙， 马玉龙， 杨玲玲

(河北医科大学附属河北省人民医院心内一科， 河北 石家庄 050051)

目的： 探讨半乳糖凝集素3(galectin-3，Gal-3)与心肌纤维化的关系，明确Gal-3在缺血性心功能不全家兔心室重构中的作用。方法: 采用结扎冠状动脉前降支的方法制作缺血性心功能障碍家兔模型。利用随机数字表法将20 只家兔随机分为假手术组和心功能不全组。造模成功4周后采用心脏超声测定心功能；real-time PCR和Western blot方法分别检测心肌中Gal-3、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的 mRNA 表达和蛋白含量；ELISA法检测家兔血清中Gal-3水平；采用HE染色和Masson染色法检测家兔梗死区心肌组织的纤维化程度。结果: 与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织Gal-3的mRNA和蛋白表达明显增加，与此同时Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达也明显增加；血清Gal-3水平明显上升；病理学观察可见心功能不全组的心肌细胞形态不一、排列紊乱，纤维组织明显增生。结论: Gal-3加重了缺血性心功能不全家兔的心肌纤维化，促进了心室重构和心衰的发生。

半乳糖凝集素3； 心力衰竭； 心肌梗死； 心室重构； 心功能不全

心力衰竭是一种复杂的临床症候群，是各种心血管疾病的严重阶段。心室重构被认为是心衰发展的基础，已有在众多基础实验和临床实验研究表明，心室结构重构在心衰的发生与发展中起着关键作用。心室结构重构包括心室的大小、形态和组织结构的改变，心脏结构和功能的改变往往早于患者出现相应的临床症状[1]。近年来，减慢或延缓心室重构的进展成为治疗心衰的主要方向，然而心衰的心室结构重构分子机制尚未明确。半乳糖凝集素3(galectin-3，Gal-3)是巨噬细胞分泌的一种β-半乳糖苷激素，是一种强大的炎症信号分子，参与调节细胞黏附、活化和趋化，参与免疫应答，调节细胞生长及凋亡等过程[2]。近期已有众多研究表明Gal-3在众多心血管疾病中也起着重要作用[3-5]，它参与心室重构和心衰的病理过程并且对心衰的预后有预测作用。目前国内对Gal-3与心衰和心室重构的关系尚不完全明确。本研究通过检测Gal-3在缺血性心功能不全家兔中的表达，探讨Gal-3与心肌纤维化的关系，明确Gal-3在缺血心功能不全心室重构中的作用，为心衰的临床治疗提供基础支持。

材 料 和 方 法

1 实验动物

本实验选用健康 3 月龄新西兰雄性家兔(合格证号为1606173)共 20只，体重约2.5 kg，由河北医科大学实验动物中心提供。

2 主要实验仪器及试剂

心脏超声仪(TOSHIBA)；低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；QL-902涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)；LineGene 9600 Plus荧光定量PCR仪(Bioer Technology)；兔血清Gal-3 ELISA试剂盒(上海蓝基科技公司)；HiFiMMLV cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture (With ROX)和5×RNA loading buffer(北京康为世纪生物科技有限公司)；载玻片(海门市世态实验器材制造公司)；分析纯二甲苯(兆京化工厂)；苏木素和0.5%伊红(Sigma)。

3 方法

3.1 动物的分组及处理 按照随机数字表法将20只家兔分为心功能不全组和假手术组各10只，采用开胸结扎冠状动脉法制备心功能不全模型。

3.2 实验动物模型制备 心功能不全组采用结扎前降支的方法制作心功能障碍模型。记录术前心电图后开胸结扎冠状动脉前降支，模型制备成功标准为心尖部及左室前壁由红色变为暗紫色，局部心肌运动异常，心电图示胸前导联 ST 段持续弓背向上抬高[6]。假手术组只开胸不结扎冠状动脉前降支，模型制备后心尖部及左室前壁没有颜色变化，心肌运动无异常，心电图示胸前导联 ST 段未抬高。2组术后每天肌注青霉素8×105U，共3 d。

3.3 超声心动图检测心功能 术前、术后2 周及术后4周由同一专科医生行超声心动图检查，测量2组左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)。所有测量值均取3 次测量的平均值。

3.4 Real-time PCR 法检测梗死区心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的mRNA表达 造模后4 周，取50 mg 心肌梗死区域心肌组织进行研磨，提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳测其完整性; 按照反转录试剂盒说明书进行反转录，反应条件为： 42 ℃ 50 min， 95 ℃ 5 min。β-actin 的上游引物为5’-AGATCGTGCGGGACATCAAG-3’，下游引物为5’-CAGGAAGGAGGGCTGGAAGA-3’，扩增产物为182 bp；Ⅰ型胶原的上游引物为5’-TGAGCCAGCAGATTGAGAACAT-3’，下游引物为5’-TGTCGCAGAAG ACCTTGATGG-3’，扩增产物为165 bp；Ⅲ型胶原的上游引物为5’-GTACAACTAGCATTCCTCCGACTG-3’，下游引物为5’-TTAGAGCAGCCATCCTCCAGAAC-3’，扩增产物为203 bp; Gal-3的上游引物为5’-CTGTGCCTTATGACCTGCCTCT-3’，下游引物为5’-TCATTGACCGCAACCTTGAAGTG-3’，扩增产物为301 bp。将获得的cDNA 按照实时荧光定量PCR 试剂盒操作说明书方法扩增目的基因，PCR 热循环参数为： 96 ℃ 4 min； 95 ℃ 10 min， 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s， 45 个循环。以β-actin为内参照，将目的基因表达的相对定量值用于统计学分析。Real-time PCR 采用2-ΔΔCt法计算结果[7]。将所得的Gal-3的mRNA表达量与LVEF 进行相关分析。

3.5 Western blot法检测梗死区心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的蛋白含量 将梗死区的心肌组织称重后研磨提取组织中的蛋白，根据目的蛋白的分子量，配制8%、12%的分离胶和5%浓缩胶，进行丙烯酰胺凝胶电泳，然后湿转膜，孵育相应Ⅰ、Ⅱ抗，ECL发光反应检测并分析目的蛋白含量。将所得的Gal-3蛋白量与LVEF 进行相关性分析。

3.6 ELISA法检测血清中Gal-3的含量 分别在术前、术后2周和术后4周，经家兔耳中动脉取血，离心15 min 后取上清，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作；依据标准品浓度及其吸光度(A)计算相应公式，依据公式和样品A值计算样品Gal-3 的浓度，然后将所得的血清Gal-3 的浓度与LVEF 进行相关分析。

3.7 组织病理观察 采用HE染色和Masson染色法观察家兔梗死区心肌组织纤维化程度。

4 统计学处理

使用 SPSS 21.0软件包进行数据处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用两独立样本t检验。相关变量间采用直线相关分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 心肌梗死后心功能障碍模型结果

20只新西兰雄性家兔在造模后共有16 只存活，其中心功能不全组存活 8只，死亡2只，因结扎前降支的过程中诱发室颤而死亡；假手术组存活8只，死亡2只，其中1只于手术过程中大出血死亡，另1只开胸过程中发生气胸而死亡。

2 超声心动图检查结果

对造模前心功能不全组和假手术组的超声结果行两独立样本t检验，结果显示LVEF和LVEDD差异无统计学显著性，说明2组家兔在造模前的心功能是一致的。

对造模后2周和4周的心功能不全组和假手术组的超声结果行两独立样本t检验，结果显示LVEF和LVEDD差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，心功能不全组LVEF明显下降，LVEDD明显增大，见表1。

表1 2组造模后4周LVEF和LVEDD的比较

Table 1.Comparison of LVEF and LVEDD in the 2 groups 4 weeks after modeling (Mean±SD.n=8)

GroupLVEF(%)LVEDD(mm)Shamoperation61.36±5.4511.81±0.31Cardiacinsufficiency40.22±0.87*16.59±0.54*

*P<0.05vssham operation group.

3 梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的mRNA表达

与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的mRNA表达明显增加。Gal-3的mRNA水平与LVEF存在负相关关系(r=-0.923，P<0.05)，见表2。

表2 2组梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和Gal-3的mRNA表达及Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原mRNA比值的比较

Table 2.The mRNA expression of type Ⅰ collagen, type Ⅲ collagen and Gal-3， and the ratio of type Ⅰ collagen/type Ⅲ collagen mRNA (ratio) in the 2 groups (Mean±SD.n=8)

GroupTypeIcollagenTypeIIIcollagenGal-3RatioShamoperation1.15±0.920.93±0.591.20±0.151.26±0.16Cardiacinsufficiency4.71±0.51*2.43±0.48*7.23±0.88*2.02±0.51*

*P<0.05vssham operation group.

4 梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的蛋白含量

Western blot的检测结果表明，与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织中Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的蛋白含量显著增加。Gal-3的蛋白含量与LVEF存在负相关关系(r=-0.909，P<0.05)，见图1、表3。

5 血清Gal-3的含量

对心功能不全组和假手术组术前血清中Gal-3的浓度进行两独立样本t检验，差异无统计学显著性。分别对2组术后2周和4周血清中Gal-3的浓度进行t检验，结果显示2组差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，术后2周到4周血清Gal-3的含量逐渐增加。血清Gal-3的浓度与LVEF存在负相关关系(r=-0.89，P<0.05)，见表4。

Figure 1.The representative images of Western blot for determining the protein levels of Gal-3, type I collagen and type Ⅲ collagen in the 2 groups.

图1 梗死区心肌组织Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的Wes-tern blot检测结果

表3 2组梗死区心肌组织Gal-3、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量比较

*P<0.05vssham operation group.

表4 2组术前、术后2周和术后4周后血清Gal-3含量的比较

Table 4.The levels of serum Gal-3 in the 2 groups before operation (0 week)， and 2 and 4 weeks after operation (μg/L. Mean±SD.n=8)

Group0week2weeks4weeksShamoperation5.50±0.175.63±0.125.49±0.16Cardiacinsufficiency5.48±0.295.80±0.25*7.68±0.34*

*P<0.05vssham operation group.

6 病理组织结果

假手术组和心功能不全组心梗区心肌组织，经石蜡包埋切片、Masson染色和HE染色。HE染色后于光镜下观察，可见假手术组心肌细胞形态均一、排列整齐。细胞质染色均匀，呈淡红色，胞核大小一致，呈椭圆形或圆形，居胞质中央；心功能不全组心肌细胞形态大小不一、排列紊乱，细胞质染色不均匀呈散点状，细胞核消失或呈梭型。Masson染色镜下可见假手术组心肌细胞形态均一，红色心肌细胞染色均匀，蓝色纤维组织较少，心功能不全组梗死区心肌细胞形态消失，取而代之的是成纤维细胞及粗大的胶原纤维束，排列疏松，见图2。

Figure 2.Masson and HE stained images of sham operation group and cardiac insufficiency group (×10).

图2 假手术组与心功能不全组HE染色和Masson染色的图片

讨 论

近代人们通过对心衰的心脏结构与功能改变长期研究，Baumbach等[8]于1989年首次提出心室重构这个概念。心室重构一直被认为是心衰发展的基础，是心衰患者发病率和死亡率的决定因素，所以减慢或延缓心室重构的进展也成为治疗心衰的主要方向，然而心室重构分子机制还尚未明确。纵观近几年研究发现Gal-3与心室重构的关系备受关注，目前已有众多文章表明Gal-3很可能是参与心室重构的一个分子机制。Kortekaas等[9]研究了Gal-3与左室重构的关系。研究证明Gal-3高水平与逆转左室重构有关。Lok等[10]的研究显示，在严重慢性心衰患者中Gal-3和左室重构有关，并能预测远期死亡率。

本研究通过病理图片可以从组织结构上看出与假手术组相比，心功能不全组心肌细胞形态不一、排列紊乱，纤维组织增生明显。 Real-time PCR 结果表明与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织Gal-3的mRNA表达明显增加，与此同时Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原比值也明显增加。由此可以说明心功能不全组家兔心肌组织中，心肌间质胶原蛋白沉积，Ⅰ型胶原升高更明显。Gal-3的mRNA表达水平与LVEF做相关性分析结果显示，Gal-3与LVEF存在负相关，且为强相关，这就表明随着Gal-3水平的升高，心功能在逐渐下降。Western blot实验结果表明与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织中Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的蛋白含量显著增加。Gal-3的蛋白含量与LVEF做相关性分析结果显示，Gal-3与LVEF存在负相关关系。与假手术组相比，心功能不全组造模后4周血清Gal-3的含量明显增加且与LVEF呈负相关关系，这就表明随着血清Gal-3水平的升高心功能在逐渐下降，这也将为Gal-3成为心衰指标提供了依据。上述结果与病理组织结构改变是一致的。由此可见随着Gal-3水平的升高，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达增加，心肌胶原网的构架改变，心肌纤维化加重，促进了心室肥厚和心室重构过程，促进了心功能下降和心衰的发生。

心室重构是引起心力衰竭的重要病理生理机制之一，被认为是心衰发展的基础，是心衰患者发病率和死亡率的决定因素，所以减慢或延缓心室重构的进展成为治疗心衰的主要方向。本研究已证实Gal-3促进了心肌纤维化，参与了心室重构过程，故可能成为心衰治疗的一个新靶点。Gal-3相关抑制剂可能会给减慢或逆转心室重构和心衰的治疗注入新力量，但Gal-3能否真正成为心衰治疗的靶点，其抑制剂能否逆转心室重构、改善患者预后均有待于进一步研究。

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[10]Lok DJ, Lok SI, Bruggink-André de la Porte PW, et al. Galectin-3 is an independent marker for ventricular remodeling and mortality in patients with chronic heart failure[J]. Clin Res Cardiol, 2013, 102(2):103-110.

(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Effect of galectin-3 on ventricular remodeling in rabbits with ischemic cardiac insufficiency

ZHANG Yue-hua, LI Shu-ren,DENG Wen-hao,HAO Xiao, LI Sha,MA Yu-long, YANG Ling-ling

(DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China.E-mail:lsr64@126.com)

AIM: To investigate the relationship between galectin-3 (Gal-3) and myocardial fibrosis, and to clarify the role of Gal-3 in ventricular remodeling in rabbits with ischemic cardiac insufficiency. METHODS: A rabbit model of ischemic cardiac insufficiency was established by ligation of the anterior descending branch of the coronary artery. The 20 rabbits were randomly divided into sham operation group and cardiac insufficiency group by random number table method. After 4 weeks of coronary artery ligation, the cardiac function was measured by cardiac echocardiogram. Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression of Gal-3, type I collagen and type III collagen at mRNA and protein levels in the myocardium. The serum Gal-3 contents were measured by ELISA. HE staining and Masson staining were used to observe the degree of fibrosis development in myocardial tissues after infarction. RESULTS: Compared with sham operation group, the mRNA expression of Gal-3 in cardiac insufficiency group was significantly increased. At the same time, type I collagen, type III collagen and collagen type I/III ratio were also increased significantly. The protein contents of Gal-3, type I collagen and type III collagen were increased significantly. The serum Gal-3 levels were significantly increased. The pathological changes were observed in cardiac insufficiency group as the myocardial cell morphological disorder and marked hyperplasia of fibrous tissue were seen. CONCLUSION: Gal-3 aggravates myocardial fibrosis in rabbits with ischemic cardiac insufficiency, and promotes the ventricular remodeling and the occurrence of heart failure.

Galectin-3; Heart failure; Myocardial infarction; Ventricular remodeling; Cardiac insufficiency

1000- 4718(2017)07- 1226- 05

2016- 11- 15

2017- 03- 24

R541； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.012

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 0311-85988732; E-mail: lsr64@126.com)