miR-214通过靶向调控E2F3抑制肝癌细胞的增殖

杜朝阳，杨如玉，李 超，段丽娟

(河南省南阳市中心医院血液科，河南 473001)

miR-214通过靶向调控E2F3抑制肝癌细胞的增殖

杜朝阳，杨如玉，李 超，段丽娟

(河南省南阳市中心医院血液科，河南 473001)

目的 探讨miR-214通过靶向调控E2F转录因子3(E2F3)抑制肝癌细胞的增殖。方法 RT-PCR法检测细胞株SMMC-7721、HepG2、SK-Hep-1和Huh 7中miR-214的表达量，并利用脂质体转染miR-214 NC及miR-214 mimics。采用MTT法检测miR-214对肝癌细胞活力的影响；Hoechst染色试剂盒检测miR-214对细胞凋亡的影响，流式细胞术检测miR-214对细胞周期的影响；Western blot及RT-PCR法检测miR-214对肝癌细胞中E2F3蛋白及mRNA表达量的影响，并通过荧光素酶报告基因进行验证。结果 SMMC-7721、SK-Hep-1、Huh 7及HepG2中miR-214的表达量分别为(0.83±0.08)、(0.32±0.03)、(0.33±0.03)、(0.08±0.01)，其中HepG2中miR-214表达量最低，因此选用HepG2作为后续实验细胞株。HepG2细胞转染miR-214 NC及miR-214 mimics、miR-214 mimics组中miR-214表达量(0.65±0.06)明显高于miR-214 NC组(0.14±0.01)，miR-214 mimics组细胞活力(0.35±0.03)明显低于miR-214 NC组(0.69±0.06)，miR-214 mimics组细胞凋亡率(36.37±3.43)%明显高于miR-214 NC组(3.74±0.34)%，miR-214 mimics组G1期明(57.79±5.78)显长于miR-214 NC组(45.319±4.53)，miR-214 mimics组中E2F3蛋白[(0.23±0.02)、(0.24±0.02)]及mRNA表达量明显低于miR-214 NC组[(0.98±0.09)、(0.99±0.10)]，差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论 miR-214过表达能通过下调E2F3表达抑制肝癌细胞的增殖。

miR-214，肝癌细胞；E2F3；增殖

原发性肝癌是肝细胞或肝内管细胞发生的恶性肿瘤，其中90%为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，是位居世界第五位及致死率第3位的肿瘤[1, 2]。目前，手术切除和肝移植是HCC最为有效的治疗方法，然而，临床研究表明超过50%的接受肝切除术的HCC患者出现术后复发[1, 2]。因此，探讨肝癌的发生发展的相关机制，对于肝癌的诊断，治疗及预后具有重要的意义。

MicroRNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA，能够结合于靶基因mRNA的3’-UTR区域，降解或者阻遏靶基因的翻译，从而抑制靶基因的表达。近些年大量研究证实miRNA在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，包括肝癌[3]。miRNA微阵列研究显示，miR-214在肝癌组织中的表达明显低于正常肝组织[4]。同时恢复肝癌细胞中miR-214的表达，能显著的抑制细胞的增殖，但具体的作用机制未知。而miRNA对细胞生物学行为的调控作用，大部分源于其对靶基因的调控作用[5, 6]。研究表明E2F家族基因E2F转录因子3(E2F3)在肝癌组织中高表达，并与肝癌的发生发展密切相关，且有研究显示miR-214与E2F3在多种病理情况下的表达具有相关性[7, 8]，提示miR-214可能通过调控E2F3调控细胞的生物学行为。所以本研究将在此基础上，探讨miR-214在肝癌细胞株中的表达，及恢复其表达后对细胞的增殖、凋亡行为的影响及具体机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株

人SK-Hep-1购于中国科学院细胞库。人HepG2、SMCC-7721、Huh 7购于美国菌种保藏中心(ATCC)。

1.2 试剂及主要仪器

四唑盐试剂(MTT)(美国Sigma公司)；兔抗E2F3、GAPDH单克隆抗体(美国Epitmics公司)；trizol试剂盒(美国Corning 公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，Hoechst染色试剂盒，细胞周期检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；胎牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶(Gibco公司)；结晶紫(Sigma公司)。CO2培养箱，超净工作台(美国Thermo Scientific公司)；TS100倒置显微镜(日本Nikon公司)；FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD 公司)；迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪，ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 miRNA合成、配制、存储及转染

在广州市锐博生物科技有限公司订购合成miR-214 mimic及对照mimic negative control(miR-214 NC)。合成样品先离心，然后每5 nmol miRNA中加入250 μL DEPC水稀释，配成20 μmol/L母液，分装，-20℃保存备用。转染前1 d，在无双抗培养基中接种细胞(6孔板，每孔加2000 μL，其他按比例增加或减少)，转染时细胞的汇合度要达到50%；用适量无血清Opti-MEM® I培养基稀释miRNA (250 μL)，轻轻混匀。摇匀Lipofectamine 2000，取适量用Opti-MEM® I稀释并轻轻混匀后室温孵育5 min。将稀释的Lipofectamine 2000和稀释的miRNA轻轻混合，室温孵育(20～30) min；将miRNA/Lipofectamine 2000复合物加入6孔板，前后轻轻摇动混合；6 h以后换成含10%血清的DMEM培养基，于37℃，CO2培养箱培养，并用RT-PCR检测miR-214的表达。

1.4 MTT检测细胞活力

将处于生长对数期的HepG2细胞消化，细胞浓度调整为2×104个/ mL，接种于96孔板，每孔200 μL，转染48 h后，加入20 μL终浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h后，加150 μL 二甲基亚砜，震荡10 min，采用酶标仪于570 nm处测吸光度(A)值，每个实验组三个平行复孔。

1.5 Hoechst染色检测细胞凋亡

将处于生长对数期的HepG2细胞接种于6孔板，细胞浓度调整为1×104个/ mL，接种于6孔板，每孔1 mL，转染48 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，加入Hoechst 33258染色液避光染色15 min，PBS洗涤3次，在荧光显微镜下观察并拍照。每个实验组三个平行复孔。

1.6 流式细胞术检测细胞周期

将处于生长对数期的HepG2细胞接种于6孔板，细胞浓度调整为1×104个/ mL，接种于6孔板，每孔1 mL，转染48 h后，按细胞周期检测试剂盒说明书进行检测：用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，离心，并重悬，接着加入5 μL终浓度为10 mg/mL 的Rnase，37℃孵育1 h，再加入 碘化丙啶染液，室温下避光染色 30 min，用流式细胞仪进行细胞周期检测分析。每个实验组三个平行复孔。

1.7 RT-PCR验证miR-214在不同肝癌细胞株中的表达

参考trizol试剂盒使用说明书提取总RNA，并用微量紫外分光光度计检测RNA的纯度，通过一步法RT-PCR试剂盒将逆转录RNA，并进行PCR扩增，最后将扩增产物用于2%的琼脂糖胶电泳。引物分别加入25 μL PCR反应体系中，反应条件为94℃变性45 s，59℃复性45 s，72℃延伸60 s，共35个循环。miR-214上游引物：5’-GGACAGGACGCACAGTCA-3’，下游引物：5’- CAGACGAGGCTCCGTGGT-3’，E2F3上游引物：5’- AGAAAGCGGTCAATCAGTACCT-3’，下游引物：5’- TGGACTTCGTAGTGCAGCTCT-3’，GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’- TGGACTCCACGACGTACT-3’。

1.8 Western blot检测E2F3的表达

将处于生长对数期的HepG2细胞接种于6孔板，细胞浓度调整为1×104个/ mL，接种于6孔板，每孔1 mL，转染48 h后，刮下细胞，离心，后加入适量的RIPA裂解液，裂解30 min，离心，小心吸取上清液，即可获得总蛋白。根据BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，后湿法转膜30 min左右。将膜浸入一抗溶液(兔抗E2F3，GAPDH单克隆抗体，稀释度1:100)孵育，4℃过夜；次日二抗溶液(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L))中室温孵育1～2 h。将膜取出漂洗，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件统计分析各抗体条带灰度值。每个实验组三个平行复孔。

1.9 荧光素酶报告基因表达分析

miR-214及E2F3重组载体共转染到HepG2细胞中。分组如下： miR-214 mimics+Wt E2F3，miR-214 NC+ Wt E2F3，miR-214 mimics+Mut E2F3，miR-214 NC+ Mut E2F3。应用双荧光素酶检测系统检测转染好的荧光素酶活性，计算公式：相对荧光值=萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值。每个实验组三个平行复孔。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 四株肝癌细胞中miR-214的表达情况

如图1，RT-PCR结果显示，miR-214在SMMC-7721、SK-Hep-1、Huh 7及HepG2细胞中的表达情况分别为(0.83±0.08)，(0.32±0.03)，(0.33±0.03)，(0.08±0.01)，其中HepG2中miR-214表达量最低，因此选用HepG2作为后续实验细胞株。

2.2 miR-214 mimics对HepG2肝癌细胞中miR-214表达量的影响

如图2所示，RT-PCR结果显示，miR-214 NC及miR-214 mimics在HepG2细胞中的表达量分别为(0.14±0.01)，(0.65±0.06)，二者比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3 miR-214 mimics对肝癌细胞活力的影响

HepG2细胞转染miR-214 NC及miR-214 mimics，经MTT实验发现，二者细胞活力分别为为(0.69±0.06)，(0.35±0.03)，二者比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.4 miR-214 mimics对肝癌细胞凋亡情况的影响

如图3所示，HepG2细胞转染miR-214 NC及miR-214 mimics，经annexin V/PI流式细胞术检测发现，二者细胞凋亡率分别为(3.74±0.34)%，(36.37±3.43)%，二者比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.5 miR-214对肝癌细胞周期的影响

如图4所示，HepG2细胞转染miR-214 NC及miR-214 mimics，二者G1期细胞数目分别为(45.319±4.53)，(57.79±5.78)，二者比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.6 miR-214对HepG2肝癌细胞中E2F3表达量的影响

如图5所示，HepG2细胞转染miR-214 NC及miR-214 mimics，二者细胞中E2F3的mRNA及蛋白表达量分别为(0.98±0.09)，(0.24±0.02)及(0.99±0.10)，(0.23±0.02)，二者比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.7 荧光素酶报告基因表达分析

将miR-214 mimics、miR-214 NC及野生型载体pMir E2F3 3’UTR-Wt、及突变型载体pMir E2F3 3’UTR-Mut转入HepG2细胞中，结果发现，miR-214 mimics与野生型载体pMir E2F3 3’UTR-Wt共转染组的荧光信号强度明显弱于其它转染组，差异具有统计学意义(P<0.01)。而对于突变型载体pMir E2F3 3’UTR-Mut来说，各组间荧光强度无任何差别(P>0.05)，说明E2F3是miR-214下游靶基因。见图6。

3 讨论

原发性肝癌在恶性肿瘤发病中居世界前五，也是世界第三大致死性癌症[1, 2]。研究表明，在各种病理、生理过程，包括癌症过程中，许多miRNAs异常表达[3]。miRNAs作为一类新型的调节因子，既可以作为原癌基因发挥作用，也可以作为抑癌基因进而调节细胞的生物学特性[3]。miR-214是在小鼠，大鼠及鸡等种属中高度保守的非编码RNA分子，位于染色体1q24.3。最初把miRNAs和癌症联系在一起是在慢性淋巴细胞白血病的研究中，研究发现在大多数的这类病人中miR-15a和miR-214-1的表达是下调或是缺失的[9]。后续miRNA微阵列进一步的证实肝癌组织中miR-214的表达低于癌旁组织[4]。提示miR-214在肝癌组织中是作为抑癌基因存在的，并参与肝癌的发生发展过程。因此本研究在此基础上首先通过RT-PCR法检测4株肝癌细胞株SMMC-7721、SK-Hep-1、Huh 7及HepG2中miR-214的表达，结果表明miR-214在HepG2的表达量最低，因而选为后续实验细胞株。接着通过RT-PCR法证实了miR-214 NC及miR-214 mimics成功转染HepG2细胞。所以进一步采用MTT法，Hoecsht染色法检测miR-214 mimics对HepG2细胞活力及凋亡情况的影响，结果表明miR-214 mimics能显著的降低细胞活力，并提高细胞凋亡率，与Xu等[5]在骨肉瘤细胞，Yang等[6]在胃癌细胞株的研究结果一致，从而说明恢复miR-214的表达能显著的抑制HepG2的增殖，并诱导细胞凋亡。而肿瘤细胞的不可控制的生长增殖源于细胞周期的紊乱，其中细胞周期一般分为G1、G2/M及S期，且G1期及G2期是多数抗癌药物作用肿瘤细胞的靶点[10]。miR-214能够通过调控细胞周期相关蛋白Cyclin D1，CDK3及CDK6的表达，从而使细胞周期阻滞于G1期，最后使肝癌细胞DNA复制及有丝分裂阻断，最终导致细胞增殖受阻[11, 12]。所以本研究采用流式细胞术检测miR-214 mimics对HepG2细胞周期的影响，结果与上述报道一致[11, 12]，miR-214 mimics能显著的延长HepG2细胞的G1期，使细胞周期阻滞于G1期，最终导致细胞增殖阻断。

注：1：miR-214 NC；2：miR-214 mimics图5 miR-214 mimics对HepG2肝癌细胞中E2F3表达量的影响Fig.5 Effect of miR-214 mimics on expression of E2F3 in the HepG2 cells

注：1：SMMC-7721；2：SK-Hep-1；3：Huh 7；4：HepG2图1 四株肝癌细胞中miR-214的表达情况Fig.1 Expression of miR-214 in the four hepatocellular carcinoma cells

注：1：miR-214 NC；2：miR-214 mimics图2 miR-214 mimics对HepG2肝癌细胞中miR-214表达量的影响Fig.2 Effect of miR-214 mimics on expression of miR-214 in the HepG2 cells

注：1：miR-214 NC；2：miR-214 mimics图3 miR-214 mimics对HepG2肝癌细胞凋亡情况的影响(×200)Fig.3 Effect of miR-214 mimics on cell apoptosis in the HepG2 cells

注：1：miR-214 NC；2：miR-214 mimics图4 miR-214 mimics对HepG2肝癌细胞周期的影响Fig.4 Effect of miR-214 mimics on cell cycle in the HepG2 cells

1：pMir E2F3 3’UTR-Wt；2：pMir E2F3 3’UTR-Mut图6 荧光素酶报告基因表达分析Fig.6 Luciferase reporter gene expression analysis与miR-214 NC比较，**P<0.01Compared with the miR-214 NC,**P<0.01

miRNAs对肿瘤细胞生物学行为的影响，一般是通过调控靶蛋白表达量来实现的，有报道证实1/3蛋白的转录表达是由miRNAs所调控的[13]。E2F家族最初是在腺病毒E2基因的研究中发现的，后面陆续发现了8个的E2F家族成员，这8个E2F家族成员，由于结构上的差异，导致了功能上的不同。其中E2F3属于激活的亚群，能够促使静息细胞快速的从G1期进入S期，在细胞的增殖与凋亡过程中发挥着重要的作用。同时研究已经显示E2F3在肝癌组织中高表达，且通过下调E2F3表达，能促使肝癌细胞周期阻滞在G1期[8, 14]。另外研究已经表明miR-214与E2F3在多种病理过程中的表达量具有相关性，且有研究也发现E2F3是miR-214的靶基因[14, 15]。所以本研究利用荧光素酶报告基因检测E2F3是否是miR-214的靶基因，结果表明野生型的E2F3活性被miR-214 mimics显著下调，提示E2F3是miR-214的靶基因，接着采用western blot检测miR-214 mimics对E2F3蛋白及mRNA表达量的影响，结果表明miR-214 mimics能显著的降低E2F3蛋白及mRNA的表达，进一步的证实了E2F3确实是miR-214的靶基因。

综上所述，提高肝癌细胞HepG2中miR-214的表达，能显著的降低细胞活力，提高细胞凋亡率，并使细胞周期阻滞在G1期，同时能够靶向的下调E2F3表达。

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Inhibition of the proliferation of hepatocellular carcinoma cells by miR-214 via regulation of E2F3 expression

DU Zhao-yang, YANG Ru-yu, LI Chao, DUAN Li-juan

(Department of Hematology, Nanyang Central Hospital, Nanyang, Henan Province 473001, China)

Objective To explore the effect of inhibition of miR-214 expression on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells via regulation of E2F3 expression. Methods The expression of miR-214 in SMMC-7721, HepG2, SK-Hep-1 and Huh 7 cells was examined by RT-PCR. Hepatocellular carcinoma cells were transfected with miR-214 NC and miR-214 mimics with liposomes. The expression of miR-214 was detected by RT-PCR. The cell viability was detected by MTT assay. Cell apoptosis was detected by Hoechst staining. Cell cycle was detected by flow cytometry. Western blot, RT-PCR and dual luciferase reporter gene assay were used to detect whether E2F3 was a downstream target gene of miR-214. Results The expression of miR-214 in SMMC-7721, HepG2, SK-Hep-1 and Huh 7 cells was 0.83±0.08, 0.32±0.03, 0.33±0.03, and 0.08±0.01, respectively. The expression of miR-214 in the HepG2 cells was the lowest, so HepG2 cells were selected as the subsequent experimental cell line. Compared with the miR-214 NC group, the expression of miR-214 (0.65±0.06 vs. 0.14±0.01) was up-regulated, the cell viability (0.35±0.03 vs. 0.69±0.06) was decreased, cell apoptosis rate [(36.37±3.43)% vs. (3.74±0.34)%] was increased, the G1 phase of the cell cycle (57.79±5.78 vs. 45.319±4.53) was prolonged, the expression of E2F3 protein (0.23±0.02 vs. 0.98±0.09) and mRNA (0.24±0.02 vs. 0.99±0.10) was significantly down-regulated in the miR-214 mimics group (P<0.01). Conclusion miR-214 mimics suppress the HepG2 cell proliferation via targeted down-regulation of E2F3 expression.

miR-214; Hepatocellular carcinoma; E2F3; Proliferation

杜朝阳(1974-)，女，主治医师，主要研究方向：血液内科E-mail： doctor681@163.com。

研究报告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0027-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.006

2016-10-26