血浆miRNA在鼻咽癌发生发展中的表达差异性研究

罗凤玲?杜红缨?毛进星?邝碧茹?李家祥

[摘要] 目的 应用miRNA芯片技术，研究血浆miRNA在鼻咽癌发生、发展中的表达差异性，初步筛选出与鼻咽癌相关的miRNA，为鼻咽癌早期发现、早期诊断、早期治疗提供依据。 方法 选取90例初次接受治疗的鼻咽癌患者及健康成年人60例，分别收集所有研究对象的血浆标本，分离miRNA，运用GenePix4000B芯片行比较分析病例组与对照组之间miRNA的表达是否存在差异。 结果 通过比较，各组一般资料无差异，90例鼻咽癌患者临床分期为Ⅰ期组20例，Ⅱ期组20例，Ⅲ期组25例，Ⅳ期组25例；通过miRNA芯片检测发现差异表达miRNA31个，在这31个miRNA中，上调有26个，下调有5个，差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论 鼻咽癌患者和健康人血浆中含有的miRNA表达存在差异，提示miRNA参与到鼻咽癌病情的发生以及发展当中，可为鼻咽癌的早期发现，早期诊断，早期治疗提供理论依据。

[关键词] 鼻咽癌；miRNA；表达；差异性

[中图分类号] R739.63 [文獻标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）09-217-03

Differential expression study of plasma miRNA in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma

LUO Fengling DU Hongying MAO Jinxing KUANG Biru LI Jiaxiang

Department of Oncology，Zhaoqing First People's Hospital，Zhaoqing 526000，China

[Abstract] Objective To study the differential expression of plasma miRNA in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma by miRAN chip technology，to conduct the preliminary screening of the miRNA associated with nasopharyngeal carcinoma，and to provide evidence for early detection，early diagnosis and early treatment of nasopharyngeal carcinoma. Methods 90 patients with nasopharyngeal carcinoma in the initial treatment and 60 cases of healthy adults were selected.Plasma samples were collected from all subjects to separate the miRNA.GenePix4000B chip was used to compare and analyze the differential expression of case group and control group. Results By comparison，there was no difference in general data.90 patients with nasopharyngeal carcinoma were divided into stage I group（n=20），stage II Group（n=20），stage III group（n=25）and stage IV group（n=25）.There were 31 cases different in the expression of miRNA by miRNA.Among the 31 cases of miRNA，there were Up by 26，down by 5，and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The expression of miRNA in plasma of NPC patients and healthy people is different.It is suggested that miRNA is involved in the occurrence and development of NPC.It can provide theoretical basis for early detection，early diagnosis and early treatment of nasopharyngeal carcinoma.

[Key words] Nasopharyngeal carcinoma；miRNA；Expression；Difference

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方地区最常见的恶性肿瘤之一，以明显的区域分布特征、强烈的转移倾向为显著特征[1]。大宗临床病例观察显示鼻咽癌病人不易早期发现[2]。而有关鼻咽癌的分子标志物研究中，EB病毒VCA-IgA、EA-IgA及血液中EBV-DNA拷贝数变化虽然在一定程度上可监测鼻咽癌疗效，但目前还没有被FDA承认的鼻咽癌诊断及预测预后的分子标志物[3]。如何能够早期发现、预测肿瘤对治疗的敏感性、预测预后、监测复发或转移对鼻咽癌诊治、干预具有重要的临床意义。然而，正常情况下血浆中存在miRNA，可能为细胞、组织、器官之间的信息传递方式，普通正

常人群的血浆miRNA表达谱变化不大，肿瘤细胞也可通过微泡主动释放miRNA入血，随之其表达谱可发生变化，由于血浆中miRNA分子量小且被微泡保护，稳定性好，重复性高[4]，所以血浆miRNA将有可能为肿瘤分子标志物的研究带来曙光，其临床应用意义前景广阔。本研究拟通过芯片技术，测定健康人群与鼻咽癌患者血浆miRNA表达的差异，为鼻咽癌miRNA筛选及早期诊断提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年6月1日～2016年12月1日在我院肿瘤科住院的并有完整随访资料及血样标本的初诊鼻咽癌患者90例，其中男53例，女37例，平均年龄（45.4±6.2）岁，鼻咽癌2008分期Ⅰ期组20例，Ⅱ期组20例，Ⅲ期组25例，Ⅳ期组25例。另外，选取排除重大系统性疾病及肿瘤病史的正常人血浆标本60例作为对照组，其中男36例，女24例，平均年龄（45.8±7.1）岁。所有病例均经过病理学检查确诊，既往无放疗或化疗史。按照血清采集的标准操作规程收集鼻咽癌患者的血清标本，掌握鼻咽癌患者的基本资料和临床资料。两组之间性别、年龄差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会同意，所有患者和志愿者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 血浆RNA的提取 （1）在Eppendorf 离心管中加入1mL Trizol试剂，充分振荡混匀，混匀后将溶液转移至另一个Eppendorf离心管中，加入200μL氯仿，再次充分振荡混匀；（2）将Eppendorf离心管放入离心机中，设置温度为4℃，转速为12000rpm，充分离心15min；（3）打开Eppendorf离心管，将离心后的上清液转移至另一个Eppendorf离心管中，加入500μL异丙醇溶液，混合均匀后室温于静置 15min；（4）重复第2步骤，再次离心，离心完成后，弃掉上清液，加入1Ml 75%乙醇溶液，再次充分振荡混匀；（5）再次离心：4℃，7500rpm，5min；离心完成后，打开Eppendorf离心管，弃掉上清液，并在超净工作台中干燥5～10min；（6）加入40～60μL无RNA酶的水，用枪反复吹打，帮助沉淀的RNA溶解。

1.2.2 血清总RNA中miRNA的分离 取50～100.0?g总RNA，用Qiagen公司的miRNA分离提取试剂盒对总RNA中的miRNA进行分离。

1.2.3 miRNA样品的荧光标记 利用T4 RNA连接酶对miRNA样品进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀。

1.2.4 芯片扫描、分析及数据分析 芯片使用Axon GenePix 4000B双通道激光扫描仪进行扫描，并用Axon公司的 GenePix 4000B 图像扫描仪对微阵列芯片进行扫描，同时用Axon公司的GenePix pro V6.0图像分析软件分析扫描转化得到的数字信号。

1.3 统计学方法

釆用SPSS18.0统计软件进行数据分析。计量资料以（）表示，采用t检验，计数资料以百分比表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆总RNA抽提质量

全部RNA抽提后，取使用微量核酸定量仪测定RNA浓度和纯度，用于miRNA芯片的标本总RNA检测OD260/280均在1.7～2.0之间，浓度在20～200ng/μL之间，总量均在400ng以上，结果均符合miRNA芯片检测要求，具体结果见表1。

2.2 鼻咽癌患者与正常人血浆miRNA芯片分析的差异性表达

应用芯片对鼻咽癌患者及正常对照血浆进行全基因组miRNA差异表达分析，在1891种miRNA中检测到31种表达差异（倍数>1.5，χ2=14.34，P<0.05，其中26个高表达，5个低表达）。

3 讨论

鼻咽癌作为我国两广（广东、广西）地区的高发病，给当地人们带来了极大威胁[5]。目前鼻咽癌的发病机制尚不清楚，已知的危险因素也无法从病因角度采取预防措施[6-7]。所以，鼻咽癌防控措施主要是二级预防-早期发现、早期诊断、早期治疗。鼻咽癌病例的预后与其是否早期诊断有着密切关系，我院就诊的鼻咽癌患者中，有相当一部分为中晚期患者，因为本市对鼻咽癌的早期诊断尚无较好方法，故在高发区应用miRNA对鼻咽癌早诊早治和筛查工作，可以确保最大程度地提高筛查收益，提高早期鼻咽癌的检出率和早期治疗率，有效提高鼻咽癌患者的治愈率。

目前血浆miRNA在肿瘤的研究集中在大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、头颈肿瘤等肿瘤中，并且已初步验证血浆miRNA作为诊断及预后指标的可行性，显示了良好的临床应用价值[8-9]。尽管近几年来陆续有研究报道miRNA参与鼻咽癌的发病机制，但与欧美高发的乳腺癌和前列腺癌研究相比仍是九牛一毛，更為重要的是，仅有的一些鼻咽癌miRNA研究多数集中于基础研究，少数使用了小样本的组织标本进行研究，临床意义较小，鉴于血浆miRNA在肿瘤分子标志物研究中的良好应用前景，而目前尚无鼻咽癌血浆miRNA的研究报道[10]。本研究选择从2016年开始收集的肇庆地区鼻咽癌病人血标本，获取90例的不同期、不同放疗效果的鼻咽癌患者，结合详细临床资料及随访对血浆miRNA在鼻咽癌的临床应用价值展开初步探讨。本研究表明，通过比较选择差异表达出的miRNA31个，在这31个miRNA中，上调有26个，下调有5个，Fold-Change>1.50，具有明显差异。5个下调的miRNA所对应的靶基因可能会富集在4条通路：肿瘤相关通路，嘌呤代谢途径，Wnt信号通路以及轴突导向通路[11-12]；上调miRNA不具有明显富集通路，miRNA与鼻咽癌亦存在紧密关联。相关研究表明，鼻咽癌患者组织中和健康人组织内含有的 miRNA表存在差异，提示miRNA或许参与到鼻咽癌病情的发生以及发展[13-15]。

综上所述，本研究通过分子芯片技术对初次诊断为鼻咽癌患者和健康成年人血浆中miRNA的表达谱进行比较，发现具有明显差异性表达的人源性miRNA31个，其中上调26个，下调5个，提示鼻咽癌可导致患者血浆中miRNA的改变，确定了正常健康人与鼻咽癌患者之间血浆miRNA的表达存在差异，可以为鼻咽癌的早期诊断提供生物指标，同时，能够为鼻咽癌的早期治疗及临床个体化治疗提供依据。

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（收稿日期：2017-03-31）