两种FISH试剂盒检测羊水染色体的比较

刘柯伶?贾蓓

[摘要] 目的 应用两种荧光原位杂交（FISH）试剂盒检测羊水染色体，比较两者在临床的应用效果。 方法 采用北京金菩嘉和美国雅培Vysis生产的FISH试剂盒对30例未培养的羊水进行染色体检测，比较两者在信号强度和杂交率的差异。 结果 30例样本均获得FISH检测结果，且两种试剂临床诊断符合率达到100%，杂交率无统计学意义（P>0.05）。Vysis试剂21/13染色体荧光杂交信号较强，金菩嘉试剂18染色体信号清楚，不易融合。 结论 Vysis与金菩嘉两种FISH检测试剂应用染色体异常产前诊断均可达到同样的临床诊断效果。

[关键词] 荧光原位杂交；产前诊断；染色体非整倍体

[中图分类号] R714.53 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）10-242-04

Comparative study on application of two fluorescence in situ hybridization （FISH） kits for inspecting amniotic fluid chromosomes

LIU Keling1 JIA Bei2

1.Department of Obstetrics Baoan District People's Hospital，Shenzhen 518101，China；2.Department of Obstetrics，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510512，China

[Abstract] Objective Two fluorescence in situ hybridization （FISH） kits were utilized to inspectamniotic fluid chromosomes，to compare the both kits in clinical application. Methods Two fluorescence in situ hybridization （FISH） kits from Beijing GPmedical and Abbott were utilized to inspect 30 samples of amniotic fluid chromosomes.Their differences in respect of signal intensityand hybridizing were compared. Results All samples of the 30 cases were successfully detected by the both FISH kits.The hybridizing ratethere was no significant difference （P>0.05）.Vysis kits 21/13 chromosome fluorescent hybridization signal was stronger than the GP kits.The GP kits 18 chromosomes signal was clear and not easy to fuse. Conclusion the FISH kits from the Beijing GPmedical and Abbott Vysis can make the same prenatal diagnosis for the chromosome abnormality.

[Key words] Fluorescence in situ hybridization；Prenatal dignosis；Chromosomal aneuploid

熒光原位原位杂交技术（FISH）基于分子细胞遗传学发展的学科，始于1998年，至今在临床研究中广泛应用，在产前诊断领域更是不断完善和推广[1-3]。由于商业试剂盒应用方便、高效、稳定且专业化，临床上更青睐采用FISH商业试剂盒进行产前诊断[4]，如美国雅培Vysis公司（美国），其试剂以极高的灵敏度及可重复性在临床应用中极受欢迎。目前我国金菩嘉公司（中国）自行研发成功FISH商业试剂盒可满足产前诊断系列使用。本课题通过雅培Vysis公司和金菩嘉公司分别研制的FISH试剂盒进行临床应用比较，以便国产FISH商业试剂盒的优化，增强市场竞争力。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2009年3～10月在南方医院行产前诊断的高危孕妇30例，年龄18～44岁，平均（30.4±5.3）岁。孕周17～37周，平均（23.1±4.4）周。产前诊断指征包括：（1）孕妇年龄≥35岁10例；（2）母血清唐氏筛查高风险15例；（3）超声筛查异常，指羊水过多、心室强光点、腹部双泡征、双侧脉络丛多回声区等共3例；（4）多项指征，符合前面任意两项或两项以上者1例；（5）IVF-ET术后且极度焦虑孕妇1例。所有孕妇均签署产前诊断知情同意书。选择这30例的液氮冻存的未培养的羊水标本，结合其核型分析进行两种FISH诊断试剂（金菩嘉及雅培Vysis）的检测。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 试剂盒 采用美国 VysisFISH检测试剂盒及北京金普嘉公司FISH试剂盒。

1.2.2 仪器 采用OLYMPUS公司（BX-51）的荧光显微镜、OLYMPUS公司的显微照相机、Thermobrite原位杂交仪及VideoTest公司的FISH2.0分析软件。

1.3 方法

1.3.1 常规染色体核型分析 30例产前诊断孕妇在超声指导下无菌抽取羊水20mL，其中15mL行常规羊水细胞培养，同时对其新生儿或引产的死胎进行脐血或外周血的细胞培养以核实异常的染色体核型。将这些培养的细胞均进行G显带，染色体核型分析，分析3个分裂相，嵌合体计数100个分裂相。染色体核型分析根据人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）命名。

1.3.2 FISH检测 （1）FISH标本预处理，5mL羊水在1500rpm离心去上清，加5mL KCL低渗液，37℃水浴后固定3次后去上清至1mL滴片室温过夜老化。将老化玻片加入37℃胃蛋白酶溶液消化放入2×SSC溶液漂洗2次，取出玻片依次置于70%、85%、100%乙醇梯度脱水后室温自然干燥。按照商业试剂盒程序配备各自探针备用。

1.3.2.2 DNA变性、杂交及洗涤 （1）Vysis公司FISH试剂盒：参照试剂盒说明书进行，在步骤上作根据实验室条件进行改进：将探针滴于杂交区域，放入杂交仪73℃变性1min，37℃杂交16h。杂交后放入（73±1）℃的0.4×SSC/0.3% NP-40液洗涤2min转至室温2×SSC/0.1% NP-40液，再洗涤15～30s，放入70%乙醇3min取出暗處自然干燥。（2）金菩嘉公司FISH试剂盒甲酰胺变性程序：参照试剂盒说明书进行，在步骤上作根据实验室条件进行改进：将玻片放入（73±1）℃的70%的甲酰胺/2×SSC液变性5min，将玻片依次置于-20℃的70%、80%、100乙醇进行梯度脱水。玻片自然干燥在45～50℃烤片机与变性好的探针杂交，42℃下杂交16h。杂交玻片依次放入46±1℃的50%甲酰胺/2×SSC，2×SSC，2×SSC/0.1NP-40洗涤各10min，转至2×SSC液洗涤5～10min。再转至2×SSC/0.1%NP-40液洗涤5min。70%乙醇固定取出暗处自然干燥。（3）复染与镜检：每个杂交区域加DAPI复染剂封片后室温暗处放15～20min。每张片随机分析计数50～100个间期核，并记录杂交信号。（4）在荧光显微镜下观察间期核FISH检测信号，常规随机对每组探针计数100个细胞，排除相互重叠及弥散杂交信号、杂交不均匀区域。

1.4 统计学方法

结果数据应用SPSS13.0统计，对30例杂交率进行定量配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 30例样本间期核的两种FISH试剂检测与核型分析符合率

金菩嘉及雅培Vysis两种FISH试剂检测的产前诊断符合率为100%，见表1。

2.2 临床随访确诊情况

3例21-三体胎儿和1例18-三体胎儿引产后，脐血染色体核型证实均与羊水核型分析结果一致。26例羊水染色体正常者均追踪检查其新生儿，与新生儿外周血染色体核型分析一致。

2.3 30例样本间期核FISH检测杂交率比较

两种FISH试剂杂交率的比较有显著差异（21/13试剂盒P<0.01；8xy试剂盒，P<0.01）。Vysis公司生产的探针杂交率高于金菩嘉公司，见表2。

2.4 金菩嘉及Vysis两种FISH试剂检测信号图

荧光显微镜观察下Vysis18信号异常明亮且弥散，金菩嘉18信号同样明亮但容易判读（图1）。

3 讨论

FISH技术是一种非放射性原位杂交技术，原理是在已知单链核酸上标记荧光后作为探针，按照碱基互补原则，与检测标本的目标单链核酸特异性结合，在荧光显微镜下观察杂交后的荧光信号，判断结合的染色体区域异常与否[5-6]。FISH的产前诊断应用探针，可以针对性的检测细小的单一序列（位点特异性序列LSI）、着丝粒特异性序列（CEP）和整条染色体。LSI探针可识别目标DNA的特异序列，CEP根据识别染色体着丝粒及靠近着丝粒区域的重复DNA序列来检测染色体数目。市场上销售的商业探针与配置好的阻滞剂结合融于杂交液里，遵循应用说明书上的规定的浓度和杂交参数才能得到最好的临床应用效果。自用及商用FISH试剂盒根据在临床应用的反馈和各个领域的探索推广，各个实验室均会对探针的类型、制备工艺和使用方案进行不断优化和完善[7]。本研究中的两种探针在检测羊水染色体的操作程序上，最大的区别是杂交仪的使用情况。Vysis探针配备自己研发的FISH专用杂交仪和其自动预处理系统，极大的节约人工和试剂成本，减少有害溶液的用量，严格控制反应温度和环境湿度，进一步提高实验效率和改善实验环境。相比之下，金菩嘉探针要想取得最佳的检测效果，仍需人工甲酰胺变性、杂交及杂交后的洗涤这一系列传统步骤，这将是国产探针急需改进的技术环节。

本研究表明两种试剂盒的与核型分析的诊断符合率为100%（见表1），与文献报道的相似[8-9]，具有灵敏度高及特异性强[10]，达到产前诊断应用要求。但两种FISH试剂杂交率存在差异（见表2）。Vysis公司探针杂交率优于金菩嘉，特别是21/13探针。Vysis 18信号明亮但弥散（图1），阅片计数时一部分难以判别信号个数（一个或者两个），对异常标本信号观察可发生假阳性可能；而金菩嘉18探针信号观察清晰、容易判别（图1）。18xy探针的设计碱基配对部位定在DNA的着丝粒部位[11-12]，产生的信号较为集中而明亮，方便识别和计数。而18探针信号出现弥散的原因，是因为当一些羊水细胞核进入细胞周期S期时会出现类似G2期的配对信号，即一条染色体分裂成两条染色体单体时，临近细小信号就会出现连续信号，这时阅片时计数为一个信号[13]。因探针荧光着色是根据DNA单链的螺旋排序呈纵向，所以有时着丝粒探针或较长的基因组探针产生的信号可呈连续性，这时也以一个信号计数。因此探针选取的适宜目标DNA碱基对和细胞核所处于的细胞周期是获取分离且明亮的FISH信号的重要因素[7]。

阅片中发现21、13号染色体探针信号远不如18号染色体探针信号明亮，这是由于21/13探针是针对特异性重复序列设计（串联重复alpha-卫星序列探针）的，存在个体的差异性，促成FISH探针显示的信号不稳定，甚至遇到杂交序列太短形成的信号较弱，即使在荧光显微镜下却无法观察，就会出现假阴性，导致21号染色体非整倍的漏诊[14-16]。

21/13及18XY探针与荧光素标记的技术含量不同，导致检测信号强度及分辨率不同，这也是商业试剂盒的竞争核心所在。本研究提示国产探针临床应用与世界一流的商业探针虽存在一定差距，但仍不乏亮点，我们需要总结经验完善探针质量，在不断改进中提升自身竞争力。

[参考文献]

[1] 朱宇宁.胎儿染色体异常与适宜产前诊断技术研究[D].杭州：浙江大学，2015.

[2] 谭明芳，张正昊，刘洋，等.慢性淋巴细胞白血病中FISH的应用及与其他指标相关性的分析[J].重庆医学，2015，44（9）：1246-1249.

[3] 周海丰，范玉宏，武雪亮，等.IHC和FISH 检测乳腺癌组织HER-2基因扩增及蛋白表达[J].重庆医学，2014，43（11）：1299-1301.

[4] Ho SS，Chua C，Gole L，et al.Same-day prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploides using microfluidics-fluorescence in situ hybridization[J].Prenat Diagn，2012，32（4）：321-328.

[5] Chen CP，Wang PT，L in SP，et al.Interphase FISH on uncultured amniocytes at repeat amniocentesis for rapid diagnosis of true mosaicism in a case of level Ⅱ mosaicism involving trisomy 21 in a single colony from an in situ culture of amniocytes[J]. Taiwan J Obstet Gynecol， 2014，53（1）：120-122.

[6] Bauman JG，Wiegant J，Borst P，et al.A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome label led RNA[J].Exp Cell Res，1980，128（2）：485-490.

[7] Beatty B， Mai S，Squire J.熒光原位杂交技术[M].天津：天津科技翻译出版公司，2003：196-197.

[8] Weremowicz S，Sandstrom DJ，Morton CC，et a1. Fluorescence in situ hybridization （FISH） for rapid detection of aneuploidy：experience in 911 prenatal cases[J].Prenat Diagn，2001，21（4）：262-269.

[9] Witters I，Devrienclt K，Legius E，et al.Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 in 5049 consecutive uncultured amniotic fluid samples by fluorescence in situ hybridization （ FISH）[J].Prenat Diagn，2002，22：29-33.

[10] 温韵洁，刘丽军，罗伟权，等.荧光定量PCR和FISH技术诊断肺结核的价值比较[J].现代医院，2014，11（14）：85-87.

[11] Moyzis RK，Albright KL，BartholdiMF，et al.Human chromosome-specific repetitive DNA sequences：novel markers for genetic analysis[J].Chromosoma，1987，95：375-386.

[12] Manuelidis L.（1985） Individual interphase chromosome domains revealed by in situ hybridization[J].Hum Genet，1985，71：288-293.

[13] Cremer T，Landegent J，Bruckner A，et al.Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and nonradioaetive in situ hybridization techniques：diagnosis of trisomy18 with probe Ll.84[J].Hum Genet，1986，74（4）：346-352.

[14] Wen-Lin Kuo，Hisako Tenjin，T Richard S，et al. Detection of Aneuploidy Involving Chromosomes13，18，or 21，by FluorescenceIn Situ Hybridization（FISH） to Interphase and Metaphase Amniocytes[J].Am J Hum Genet，1991，49：112-119.

[15] Devilee P，Cremer T，Slagboom P，et al.Two subsets of human alphoid repetitive DNA show distinct preferential localization in the pericentricregions of chromosomes13，18，and 21[J].Cytogenet Cell Genet，1986，41：193-201.

[16] Weier H-U，Gray JW.A degenerate alpha satellite probe，detectinga centromeric deletionon chromosome 21 in an apparently normal human male，shows limitations of the use of satellite DNA probes for interphase ploidy analysis （submitted）.

（收稿日期：2017-02-29）