楤木激素自养型细胞系生物学特性1)

殷晴晴 宋涛 张磊 代金玲 李玉花 由香玲

(东北林业大学,哈尔滨,150040) (内蒙古农业大学) (东北林业大学)



楤木激素自养型细胞系生物学特性1)

殷晴晴 宋涛 张磊 代金玲 李玉花 由香玲

(东北林业大学,哈尔滨,150040) (内蒙古农业大学) (东北林业大学)

以前期研究获得的楤木激素自养型细胞系为研究材料，利用分光光度和高压液相色谱(HPLC)法分析了该细胞系，即生长量，3种抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD 、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT)活性，细胞壁(醇不容提取物)质量分数，细胞壁中纤维素、半纤维和总果胶的质量分数，以及3种植物内源激素(植物生长素IAA、赤霉素GA3、脱落酸ABA)的生物化特性。结果显示：激素自养型细胞系高速生长，在培养的第30天达到最大生长量，鲜质量和干质量分别是非激素自养型细胞系的2.64、2.22倍。在0～30 d，激素自养型细胞系中3种抗氧化酶活性都显著高于非激素自养型细胞系。激素自养型细胞系中的细胞壁质量分数(8.94 mg·g-1)明显低于培养苗中的(13.15 mg·g-1)，高于非激素自养型细胞系的；细胞壁中总果胶的质量分数显著低于非激素自养型细胞系和组培苗的；纤维素质量分数与非激素自养型细胞系的差异不显著；半纤维素质量分数显著高于非激素自养型细胞系的。非激素自养型细胞系中GA3质量分数是激素自养型细胞系的2.6倍，两种细胞系中ABA质量分数差异不显著，激素自养型细胞系中IAA质量分数与非激素自养型细胞系中的无显著差异。

激素自养型细胞系; 楤木; 抗氧化酶活性; 内源植物激素

Habituated cell line;AraliaelataSeem; Antioxidant enzyme activity; Endogenous phytohormone

植物组织培养过程中，由于培养环境中外源性生长素的诱导，促使外植体上某些细胞中的基因按时空表达，从而导致了组织细胞分裂、脱分化及完整植株再生等一系列变化[1]。然而，1955年Gautheret[2]发现胡萝卜愈伤组织可以逐渐失去对外源性生长素的需求而生长的现象，并把这种现象称为生长素适应(或驯化)现象。现在激素自养型被定义为在培养过程中不需要任何生长调节剂(包括所有生长、分裂激素等)就能稳定生长的植物细胞系[3]。植物细胞的这种现象可以是自发或是由定向诱导产生[4]。到目前为止，已经在烟草[5]、甜菜[6-10]、马铃薯、长春花[11]等植物中获得了激素自养型细胞系。这类细胞系主要在细胞学、生物化学、分子生物学及次生代谢调控方面有重要的研究和应用价值。烟草2B-13细胞系是BY-2细胞系逐渐减少生长素直至不再添加，诱导筛选出的激素自养型细胞系。Shimizu et al.[5]发现向生长素饥饿型BY-2细胞中添加激素自养型2B-13细胞的培养液，可以诱导其半同步细胞分裂。长春花激素自养型细胞系C20hi是从激素依赖型细胞系C20D中定向诱导筛选出的不需要外源生长素、具有较高的阿玛碱合成能力且比较稳定的细胞系[11]。

楤木(Araliaelata(Miq.) Seem)属五加科(Araliaceae)楤木属小灌木。近年来，因其重要的食药两用价值而备受关注[12]。本研究中楤木体细胞胚发生过程中，偶然获得了激素自养型细胞系。其主要特点是，无需任何外源生长素和分裂素就能快速生长外。 文中主要通过分析激素自养型细胞系的生长、抗氧化酶活性差异、细胞壁质量分数及其中纤维素、半纤维素、果胶质量分数和3种内源激素质量分数，来研究该激素自养型细胞系的生物学特点，为利用该细胞系及研究其激素自养型机制奠定基础。

1 材料与方法

本研究所用楤木(Araliaelata(Miq.) Seem)的种子采自黑龙江省林业多种经营研究所(牡丹江市)种子园，由东北林业大学生命科学学院王秀华教授鉴定。种子于冰箱4 ℃层积4个月后，选择开荚的、合子胚发育成熟的种子，去除种皮，在流水下冲洗8 h，75%的乙醇浸泡10 s去除真菌，再用灭菌的蒸馏水冲洗3次，然后用50%次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水冲洗4～5次。用镊子小心取出合子胚，接种在添加2%蔗糖无激素的1/2MS固体培养基中，光培养7 d使其萌发成长为无菌苗。

激素自养细胞系和非激素自养型细胞系的获得：取上述萌发7 d无菌苗的叶柄和根段，切割为1.5 cm左右的小段接种到含MS+1.5 mg·L-12,4-D+3.0%蔗糖的固体培养基中，诱导了胚性细胞系即非激素自养型细胞系和激素自养细胞系。该培养基同时添加琼脂7.5 g·L-1，pH值调整为5.8～6.0，分装于100 mL玻璃培养瓶中。经高温高压灭菌后使用。培养室光照12 h·d-1，温度(25±2)℃。

绘制固体培养两种细胞系的生长曲线：各取鲜质量为0.3 g旺盛生长的激素自养型细胞和状态均一的胚性细胞系，分别接种于只添加3%蔗糖的1/2MS、MS+1.0 mg·L-12,4-D固体培养基中。每5 d随机收获6瓶培养的细胞，连续取样40 d，收获后测定鲜质量，经24 h烘箱60 ℃烘干至恒质量后测定干质量，绘制生长曲线。

激素滋养型细胞系中SOD、POD及CAT 3种酶活性测定：激素自养型细胞和非激素自养型细胞系从接种开始每5 d随机取样，每次取3瓶。分别测定两种细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)3种酶活性。每个指标平行重复3次。

酶液的提取参照文献[13]：称取鲜质量为0.5 g样品，置于冰浴上的研钵中，加入pH值7.8(0.05 mol·L-1)预冷的磷酸缓冲液3 mL，在研钵中迅速将样品研磨成匀浆，转入2 mL离心管中，设定3 000 r·min-1、4 ℃条件下离心10 min，在4 ℃条件下保存上清液，即酶液，备用。SOD、POD及CAT 活性测定参照文献[13]、[14]。

激素自养型细胞系中细胞壁、细胞壁中果胶、纤维素及半纤维素质量分数的测定：在细胞培养30 d时，激素自养型细胞系、非激素自养型细胞系、组培苗分别各取3份30 g为分析材料。细胞壁提取参照文献[15]。将材料放入研钵中，加入少量预冷的10 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH值=7.0)。冰上研磨至细胞全部破碎，抽滤。残渣用2 L、0～4 ℃预冷的磷酸缓冲液洗去水溶性杂质。用500 mL预冷(0～4 ℃)乙醇淋洗残渣，除去醇溶性物质。用500 mL，-20 ℃丙酮淋洗去掉脂溶性物质。65 ℃烘干提取出的细胞壁(醇不容物)，称量，统计3种材料中细胞壁的质量分数。用研钵研碎上述获得的细胞壁用于分析细胞壁中3种成分的质量分数，测定方法参照文献[16]。总果胶质量分数采用咔唑比色法测定；纤维素和半纤维素质量分数采用蒽酮比色法测定。半乳糖醛酸可由果胶水解生成，通过比色方法确定半乳糖醛酸的标准曲线为Y=0.006 03+0.005 81X(R2=0.997)，由此计算出果胶的质量分数。纤维素和半纤维素以葡萄糖为标准品，测得的标准曲线为Y=0.042 19+0.007 62X(R2=0.990)，由此可以计算出纤维素和半纤维素的质量分数。

激素自养型细胞系内源激素IAA、GA3、ABA的提取与纯化：样品的内源激素提取与纯化过程参照文献[17]。

激素自养型细胞系内源激素IAA、GA3、ABA的HPLC测定：色谱条件，色谱柱为C18反向柱，设定35 ℃柱温，总流速1.0 mL·min-1，A流动相为甲醇，B为0.8%冰醋酸溶液，进样量20 μL，检测波长为254 nm，采用外标法定量测定。按表1中的时间程序进行梯度洗脱(V/V)。测得的标准曲线，GA3为Y=94 169X-16 468 (R2=0.999 5)；IAA为Y=1×106X-155 379 (R2=0.999 7)；ABA为Y=5×106X-18 034(R2=0.999 6)。根据标准曲线计算质量分数。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 激素自养型细胞系和胚性细胞系的获得与增殖

楤木无菌苗的叶柄及根段在MS+作为外植体进行愈伤组织的诱导，3种材料均能获得白色生长旺盛、松散的白色愈伤组织，即非激素自养型细胞系。在继代过程中，发现有一块愈伤组织细胞系呈黄色松散状，为激素自养型细胞系。因为在随后的试验证实，细胞系和激素自养型细胞系在除去2,4-D的MS培养基中继代，白色细胞系死亡而黄色细胞系则依然生长旺盛。该细胞系在无任何外源激素的培养基中连续继代3 a，生长仍然很旺盛。该白色非激素自养型细胞系现在已证明为胚性细胞系[18]。

2.2 两种细胞系固体培养的生长特点

将两种细胞系在同一种固体培养基中培养40 d，定期取材，从鲜质量和干质量统计它们的生长状况，结果如图1。从图1中可以看出,两种细胞系40 d内的生长趋势几乎相同，都呈S形曲线增长，而且都是在培养30 d时，鲜质量和干质量达到最大，激素自养型细胞系的鲜质量和干质量分别为4.630、0.185 g，是接种时的14.43、9.51倍；非激素滋养型细胞系的鲜质量和干质量分别为1.755 、0.083 g，是接种时的4.84、3.55倍。从上面的数值也可以看出，培养30 d时，激素自养型细胞系的鲜质量和干质量分别是非激素自养型细胞系的2.64、2.22倍。由此可见，激素自养型细胞系生长快速。

2.3 激素自养型细胞系中SOD、POD及CAT活性的变化

为了更好地认识激素自养型细胞系的特点，在研究其生长状况的同时也对新鲜细胞系中3种抗氧化活性酶进行了分析，统计结果如图2。从图2中可以看出，在40 d的生长中，激素自养型细胞系中3种抗氧化酶活性变化幅度较大，SOD、POD活性都是先上升再下降的趋势，CAT活性则呈现持续下降趋势。而非激素自养型细胞系中这3种酶活性大致呈先降低后缓慢上升的趋势。而且0～30 d ，激素自养型细胞系的3种抗氧化物酶活性都显著高于非激素自养型细胞系中的。从图1可知，这期间正是两种细胞系快速分裂增殖的时期，激素自养型细胞系较非激素自养型细胞系生长更快，因此需要利用更多的能量，呼吸作用更强，产生更多的活性氧，从而3种抗氧化活性酶活性都处于较高的状态，以清除活性氧，保护细胞的正常生长增殖。激素自养型细胞系中3种抗氧化活性酶由于持续降低，从30 d开始非激素自养型细胞系中的3种抗氧化物酶活性超过激素自养型细胞系中的。这主要是由于激素自养型细胞系的高速增殖，致使培养基中营养不足，使细胞趋于停止生长，致使各种酶活性降低。而非激素自养型细胞系一方面由于生长速度不快，培养基中营养成分还足以维持其增殖，另一方面，该期间可能由于非激素自养型细胞处于体胚分化过程。

2.4 激素自养型细胞系细胞壁，细胞壁中果胶、纤维素及半纤维素质量分数

为了更好地认识激素自养型细胞系的特征，提取了组培苗、激素自养型细胞及非激素自养型细胞系3种材料的细胞壁(乙醇不溶物质)(图3)，从中可以看出细胞壁形态差别很大， 组培苗提取的细胞壁呈片状(图3A)，非激素自养型细胞系提取的呈颗粒状(图3B)，激素自养型细胞系提取的无明显形状，板结在一起表面呈蜂窝状(图3C)。细胞壁质量分数的数据统计结果如表2。从表2中可以看出，3种材料细胞壁质量分数差异显著，激素自养型细胞系中细胞壁质量分数 (8.94 mg·g-1)显著高于胚性细胞系的(3.01 mg·g-1)，但比组培苗中的细胞壁质量分数(13.15 mg·g-1)低。

对3种材料细胞壁中的纤维素、半纤维素和总果胶的质量分数进行分析统计如表2，从表2中可以得出，组培苗细胞壁中3种成分均较高，尤其是总果胶和纤维素质量分数。激素自养型细胞系中总果胶的质量分数显著低于非激素自养型细胞系和组培苗的，其纤维素质量分数与非激素自养型细胞系的差异不显著，半纤维素质量分数与组培苗的差异不显著，而显著高于非激素自养型细胞系的。

图2 生长周期中SOD、POD和CAT活性变化曲线

A.组培苗提取的细胞壁；B.非激素自养型细胞系提取的细胞壁;C.激素自养型细胞系提取的细胞壁(比例尺：A.5 mm;B.2 mm;C.2 mm)。

材 料细胞壁质量分数/mg·g-1细胞壁中各成分质量分数/mg·g-1总果胶纤维素半纤维素内源激素质量分数/μg·g-1GA3IAAABA激素自养型细胞系(8．94±1．121)b(168．28±13．113)c(119．44±10．082)b(63．10±5．868)a(13．173±2．1676)c(8．240±1．2651)b(5．715±0．7516)b非激素自养型细胞系(3．01±0．733)c(186．34±15．432)b(130．26±12．181)b(33．60±3．422)b(34．408±4．6522)b(7．158±0．9493)b(6．159±0．8723)ab组培苗(13．15±2．562)a(692．86±56．212)a(435．53±20．112)a(62．94±6．653)a(75．597±8．0141)a(27．647±3．4654)a(7．358±0．8432)a

注：表中数据为平均值±标准差；运用Duncan多重比较,同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.5 激素自养型细胞系中内源激素IAA、GA3、ABA的HPLC分析

对3种材料进行内源激素的提取与HPLC分析，统计结果如图4和表2。样品中3种内源激素以及他们的标准品分离效果均较好(图4)。

从表2中可以看出，激素自养型细胞系中 GA3、ABA质量分数都低于其他两种材料中的，IAA的质量分数与非激素自养型细胞系中的差异不显著，非激素自养型细胞系中GA3是激素自养型细胞系的2.6倍。

3 结论与讨论

本研究获得的楤木激素自养型细胞系在无添加任何植物生长调节剂的培养条件下，在培养0～30 d内高速生长，3种抗氧化活性酶(SOD、POD、CAT)活性也显著高于非激素自养型细胞系的。有利于清除活性氧，保护细胞的正常生长增殖。类似的研究结果有，Bouchet et al.[4]分析了烟草激素自养型细胞系细胞壁上的过氧化物酶质量分数，结果显示较高。而Hagege et al.[8]在甜菜的激素自养细胞系的研究中发现过氧化物酶的质量分数较低。

图4 3种植物激素标品(A)及样品(B)的分离HPLC图谱

关于细胞壁中各成分质量分数，激素自养型细胞系的乙醇不溶物显著高于非激素细胞系的，而显著低于组培苗的。激素自养型细胞系中的总果胶明显高于非激素自养型细胞系的，纤维素与非激素自养型细胞系无显著差异，但半纤维素质量分数显著低于非激素自养型细胞系的。Hagege[6]通过扫描电镜甜菜激素自养型细胞，观察显示这些细胞的细胞壁结构异常，细胞壁多糖组成疏松平行成丝状，初生细胞壁发育不完全。Bisbis[19]研究甜菜的激素自养型细胞系发现，与正常细胞相比，细胞壁成分减少，且发现细胞内糖代谢紊乱。

本研究中通过对激素自养型细胞中3种内源激素(IAA、GA3、ABA) 质量分数比较分析发现，激素自养型细胞系中IAA 质量分数与非激素自养性细胞系中的差异不显著。Hagege et al.[8]研究的甜菜自养型细胞系的IAA质量分数与非自养型细胞系中显示基本一样。这与本研究中IAA 质量分数结果一致。Michalczuk et al.[20]在分析比较了樱花激素自养(胚性)和非激素自养型细胞系发现，固体培养时激素和非激素自养型细胞系的自由态IAA和结合态IAA质量分数基本相同。液体培养时，非激素自养型细胞系两种IAA的质量分数没有受到影响，而激素自养型细胞系中，结合态IAA质量分数降低。通过同位素分布分析显示，主要是由于激素自养型细胞系中IAA的代谢加强所致。而Bouchet et al.[4]研究烟草激素自养型细胞系中的IAA质量分数则显著高于非激素自养型细胞系中的。

对激素自养型细胞系的研究，人们除了上述的生物化学研究外，最直接的内容就是寻找引起细胞自己分裂生长的活性物质。从烟草自养型细胞系2B-13中分析纯化获得了这样的一类活性物质——细胞分裂因子(CDF)；该因子能使生长素饥饿的BY-2细胞系恢复半同步分裂[5]。Omarzad et al.[7]利用正常和激素自养型甜菜细胞系中13C代谢溶质的核磁共振天然丰度分析，在激素自养型细胞系中，观察到了相对质量分数较多的谷氨酰胺，而这种化合物与肿瘤细胞生长的调节有关，与以丙氨酸为载体的碳骨架和氮的运输有关。研究者认为植物自养型细胞系有肿瘤细胞的性质。 文中主要完成了关于楤木激素自养型细胞系的几项生物化学方面的初步研究， 还有许多问题需进一步研究。

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1)国家林业局“948”项目(2014-4-60)、东北林业大学生命科学学院大学生创新项目(201610225232)、中央高校基本科研业务费专项资金(DL13BA10)。

殷晴晴，女，1996年1月生，东北林业大学生命科学学院， 本科生。E-mail：15546013097@163.com。

由香玲，东北林业大学生命科学学院，教授。E-mail：youxianglingqu@hotmail.com。

2017年2月25日。

S722.3+6

Biological Characteristics of the Habituated Cell Line ofAraliaelataSeem//Yin Qingqing, Song Tao, Zhang Lei(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Dai Jinling(Inner Mongolia Agricultural University); Li Yuhua, You Jinling(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(7)：69-74.

责任编辑：任 俐。

By spectrophotometer and HPLC, we studied the biological characteristics of the habituated cell line ofAraliaelataSeem including the growth, antioxidant enzyme activities (peroxidase POD, superoxide dismutase SOD and catalase CAT), cell wall composition analysis (pectin, fibrin and half-fibrin) and endogenous phytohormones (IAA, ABA, GA3) with the inhabituated cell line and the plant in vitro ofA.elataSeem as controls. The habituated cell line more quickly grew than that of inhabituated during the culture of 30 d, and the fresh and dry weights of the habituated cell were 2.64 and 2.22 times than those of inhabituated one, respectively. The activities of three antioxidant enzymes in habituated cell line were obviously higher than those in inhabituated one. The cell wall content of habituated cell line was much lower than that of the plant, and higher than that of inhabituated cell line. In the cell wall, the contents of pectin and fibrin in habituated cell line were lower significantly than those in plant and in inhabituated cell one; its fibrin content wasn’t different significantly with that in inhabituated one, and its half-fibrin content was significantly higher than that in habituated one. The content of GA3in inhabituated cell line was 4.35 times than that in habituated one, and there was almost no difference of the content of ABA in habituated and inhabituated cell line. There was no significant difference in the content of IAA between in the habituated cell line and the inhabituated one.