医用胶原蛋白调节TNF—α治疗变应性接触性皮炎的作用机制研究

孙位军++++++汪福强++++++徐文龙++++++王张++++++宋文杰++++++王杰++++++刘光丽++++++刘劲松++++++陈一龙

[摘要] 目的 研究醫用胶原蛋白调节TNF-α治疗变应性接触性皮炎的作用及机制。方法 制造二硝基氟苯致小鼠变应性接触性皮炎模型，医用胶原蛋白连续14 d涂抹动物皮肤，对耳部组织进行病理学检查，应用ELISA方法测试TNF-α、IL-2等炎症介质。 结果 与攻击前比较，各组小鼠在攻击后12、24 h均出现十分明显的耳变态反应（P < 0.01）；与空白对照组比较，医用胶原蛋白低剂量组小鼠在攻击后12 h时耳变态反应评分升高（P < 0.05），在攻击后24 h时模型对照组耳变态反应评分明显升高（P < 0.05）；与模型对照组比较，在攻击后24 h时医用胶原蛋白低、中和高剂量组小鼠的耳变态反应评分均降低（P < 0.05）。与空白对照组比较，模型对照组、地塞米松对照组和医用胶原蛋白低、中、高剂量组小鼠右耳片的炎症细胞数明显地增加（P < 0.01）；与模型对照组比较，地塞米松对照组和医用胶原蛋白低、高剂量组小鼠右耳片的炎症细胞数减少（P < 0.05或P < 0.01）。与空白对照组比较，模型对照组、地塞米松对照组和医用胶原蛋白中、高剂量组小鼠左右耳片厚度差明显地变大（P < 0.01）。与模型对照组比较，医用胶原蛋白低剂量组小鼠左右耳片厚度差变小（P < 0.05）；与空白对照组比较，模型对照组和医用胶原蛋白低剂量组小鼠血清中炎症因子TNF-α含量明显地升高（P < 0.01）；与模型对照组比较，地塞米松对照组小鼠血清中炎症因子TNF-α含量明显地降低（P < 0.01），医用胶原蛋白高剂量组小鼠血清中炎症因子TNF-α含量明显降低（P < 0.05）；对动物体重没有明显影响。 结论 医用胶原蛋白对变应性接触性皮炎有明显的治疗作用，可能通过调节血清中TNF-α进而减轻耳部炎性反应有关。

[关键词] 医用胶原蛋白；变应性接触性皮炎；炎性反应；TNF-α

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0188-05

[Abstract] Objective To study the adjust TNF-α of medical collagen treats ACD and mechanism. Methods Duplication ACD models were made， the mouse skin was smeared with this medical collagen for about 14 days as a therapy， ear tissue were given histopathological examination， ELISA was used to test the levels of TNF-α，IL-2 inflammatory mediators. Results Compared with pre attack， ear allergy were very obvious in all group after attack 12， 24 h （P < 0.01）. Compared with blank control group， the ear allergy increased in medical collagen low does group after attack 12 h （P < 0.05）， the ear allergy increased in model control group after attack 24 h （P < 0.05）. Compared with model control group， the ear allergy reduced in medical collagen low， middle， high does group after attack 24h （P < 0.05）. Compared with blank control group， inflammatory cells of the right ear increased in all group mouse （P < 0.05）. Compared with model control group， inflammatory cells of the right ear reduced in dexamethasone control group， medical collagen low， high does group （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with blank control group， the left and right ear piece thickness difference enlarged obviously in model control group， dexamethasone control group， medical collagen middle and high does group （P < 0.01）. Compared with model control group， the left and right ear piece thickness difference decreased in medical collagen low does group mouse （P < 0.05）. Compared with blank control group， TNF-α level increased obviously in model control group and medical collagen low does group mouse （P < 0.05）. Compared with model control group， TNF-α's level reduced in dexamethasone control group and medical collagen high does group mouse （P < 0.01 or P < 0.05）. Meanwhile， this therapy did not influenced the animals' weight. Conclusion Medical collagen can be a certain medical treatment for ACD， but it may connect with the adjust of the level of TNF-α and then decrease of the ear inflammation.

[Key words] Medical collagen； ACD； Inflammatory reaction； TNF-α

胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广的蛋白质，是组织的基本成分之一，约占人体蛋白质总量的1/3，分布于身体的各个器官之中。因其具有多种性质，可在细胞（尤其是成纤维细胞）表面黏附、趋化、生长、分化及介导免疫反应等方面发挥重要作用，被广泛应用于医学生物材料和临床治疗。医用胶原蛋白敷贴由Ⅰ型胶原蛋白原液和无纺布组成，用于轻中度痤疮引起的皮肤炎症的治疗，可抑制和缓解面部激光、光子治疗术后会出现的疼痛、红斑等炎性反应，还可减轻创面愈合期色素沉着，促进创面愈合。

炎性反应是痤疮发生的重要病理过程，是导致局部毛囊组织破坏而出现脓疱、结节及疤痕等的主要原因。在痤疮发生的炎性反应早期，促炎因子在炎性反应部位产生，从而促进了炎症细胞聚集继而引发一系列的炎性反应[1]。医用胶原蛋白对皮肤炎症具有明显治疗作用，但对治疗变应性接触性皮炎（ACD）及其作用机制尚未研究，研究[2-3]发现TNF-α在二硝基氟苯致ACD过程中发挥重要作用，故本研究采用二硝基氟苯致小鼠ACD，初步探讨医用胶原蛋白调节TNF-α对ACD的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物

医用胶原蛋白，临床使用的浓度为2 mg/mL，成人日用剂量为0.1523 mg/（cm2·d）[4]，由成都维德医疗器械有限责任公司提供，批号：20140301。醋酸地塞米松乳膏，由国药集团三益药业（芜湖）有限公司生产，批号：130507。

1.2 实验动物

ICR种小鼠，SPF级，64只，雌雄各半，体重18～22 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2013-24，实验动物合格证号：0018614。

1.3 实验试剂

2，4-二硝基氟苯[西亚试剂（山东分公司），分析纯]，橄榄油（成都市科龙化工试剂厂，分析纯），丙酮（成都市科龙化工试剂厂，分析纯）；以4∶1的丙酮：橄榄油配成 1%的二硝基氟苯溶液，现用现配；TNF-α、IL-2（北京永辉生物科技有限公司进口分装）；4%多聚甲醛固定液、脱水试剂、透明试剂、苏木素染液、伊红染液、盐酸-乙醇分化液、封片试剂和盖玻片清洗液等。

1.4 实验仪器

酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司生产）；2015型转轮式切片机（德国徕卡Leica仪器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋机（常州郊区中威电子仪器厂）；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）；数码三目摄像显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；电子天平（赛多利斯仪器有限公司，量程：200 g，精确度为1 mg）。

1.5 方法

1.5.1 给药 将ICR种小鼠随机分为空白对照组、模型对照组[5-6]、地塞米松对照组、医用胶原蛋白低、中、高剂量组。于小鼠右耳廓内、外两面以微量移液枪移取液体或棉签木棒段挑取乳膏均匀涂抹在皮肤表面（1 cm2）给药，连续14 d。

1.5.2 造模 在给予药物第10天后2 h进行第1次致敏，即空白对照组于腹部去毛区域涂抹50 μL的丙酮橄榄油混合液（4∶1），另外5组涂抹50 μL的1%二硝基氟苯[7-9]；在给予药物第11天后2 h同样方法进行第二次致敏。在给予药物第14天后2 h，用100 μL的生理盐水溶液洗掉小鼠右耳廓内外两侧的药物，再以10 μL的1%二硝基氟苯进行攻击。

1.5.3 测试指标 于攻击前和攻击后12、24 h分别对其双耳变态反应评分详见表1；攻击24 h后麻醉小鼠，眼球取血，分离血清，应用ELISA法测定炎症因子TNF-α和IL-2；组织病理学方法测定右耳片的炎症细胞数和左右耳片厚度差。

沿耳廓基线剪下两耳，制成HE染色切片，按参考文献[10]方法，在光学显微镜400倍镜下，取右耳片5个不重叠视野，计数炎症细胞数量（个），取平均值；在光学显微镜100倍镜下，选择左右耳组织切片中部，距耳缘端4 mm处的耳双面距离，垂直于软骨进行耳厚度测量，每只耳测量5次，取平均值；计算攻击后小鼠左、右耳厚度差（mm）。

1.6 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布时采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），其中方差齐则采用 LSD -t检验，方差不齐则采用Tamhane's T2检验，不符合正态分布时采用非参数检验（Nonparametric Tests）。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体重

与模型对照组比较，其它各组小鼠体重，在给予第1、8、15天时，差异无统计学意义（P > 0.05）。空白对照组小鼠体重，在第8天时较第1天时明显增长（P < 0.01），且第15天时较第8天时增长（P < 0.01）。地塞米松对照组小鼠体重，在给予第8、15天时较第1天时均没有明显增长（P > 0.05）。模型对照组和医用胶原蛋白低、中、高剂量组小鼠体重，在给予第8天时较第1天时明显增长（P < 0.01），但给予第15天时较第8天时没有明显增长（P > 0.05），维持在第8天的水平。见表2。

2.2 小鼠耳变态反应

攻击前，各组小鼠均未出现耳变态反应。与攻击前比较，各组小鼠在攻击后12、24 h时均出现明显耳变态反应（P < 0.01）。与空白对照组比较，医用胶原蛋白低剂量组小鼠在攻击后12 h时耳变态反应评分升高（P < 0.01），模型对照组、地塞米松对照组和医用胶原蛋白中剂量组小鼠在攻擊后12 h时耳变态反应评分升高但差异无统计学意义（P > 0.05），其医用胶原蛋白高剂量组无明显差异；在攻击后24 h时模型对照组耳变态反应评分升高（P < 0.05），其它组无明显差异。与模型对照组比较，地塞米松对照组、医用胶原蛋白中、高剂量组小鼠在攻击后12 h时的耳变态反应评分有降低趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05），在攻击后24 h时医用胶原蛋白低、中和高剂量组小鼠的耳变态反应评分均降低（P < 0.05）。见表3。

2.3 小鼠血清中炎症因子

与空白对照组比较，模型对照组和医用胶原蛋白低剂量组小鼠血清中炎症因子TNF-α含量明显升高（P < 0.01），地塞米松对照组、医用胶原蛋白中、高剂量组TNF-α含量均升高但无统计学差异（P > 0.05）。与模型对照组比较，地塞米松对照组小鼠血清中炎症因子TNF-α含量明显降低（P < 0.01）以及医用胶原蛋白高剂量组小鼠血清中炎症因子TNF-α含量降低（P < 0.05）。见表4。

2.4 小鼠右耳片炎症细胞数和左右耳片厚度差

與空白对照组比较，模型对照组、地塞米松对照组和医用胶原蛋白低、中、高剂量组小鼠右耳片炎症细胞数明显增加（P < 0.01）；与模型对照组比较，地塞米松对照组和医用胶原蛋白低、高剂量组小鼠右耳片的炎症细胞数减少（P < 0.05或P < 0.01）。与空白对照组比较，模型对照组、地塞米松对照组和医用胶原蛋白中、高剂量组小鼠左右耳片厚度差明显地变大（P < 0.01），表明涂抹二硝基氟苯再次攻击可导致小鼠右耳廓明显肿胀，而医用胶原蛋白低剂量组左右耳片厚度差异无统计学意义（P > 0.05）；与模型对照组比较，医用胶原蛋白低剂量组小鼠左右耳片厚度差变小（P < 0.05）。见表5、图1～2。

3 讨论

ACD是以炎症细胞浸润及组织变性坏死为主要病理特征的炎性反应[11]，由T细胞介导的针对皮肤接触致敏原的迟发型变态反应（Ⅳ型）。Th细胞是根据功能分类的T细胞亚群，其中Th1细胞因子主要介导细胞免疫反应；Th2细胞因子主要介导体液免疫反应，在正常情况下Th1和Th2处于动态平衡，两种细胞通过分泌不同的细胞因子彼此相互调节，维持机体的正常免疫功能[12-13]。在ACD 效应阶段，当再次接触相同致敏原时，Th1/Th2 的这种动态平衡发生失衡，以TH1细胞起主导作用，其分泌的主要炎症因子有IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-17等细胞因子[14]，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等细胞因子[15]。IFN-γ是ACD效应阶段极为重要的炎症因子，可调节抗原的呈递和淋巴细胞的的增殖与分化，是最有效的巨噬细胞激活因子，同时还能活化多种细胞，调节多种免疫活性介质的合成和分泌，加重炎性反应。研究发现IFN-γ通过刺激和调节ROS的活性而影响ACD反应。在ACD诱导致敏期，T细胞在接触抗原位点后，释放的TNF-α起着重要的作用。在抗原刺激后各种表皮细胞分泌的 TNF-α迅速增加，导致了朗格汉斯细胞从表皮迁移到了局部的淋巴结，并可以诱导炎症反应中多种细胞因子的产生，上调黏附分子和协同共刺激分子的表达[16-17]。IL-2主要是Thl 细胞在抗原或丝裂原刺激下分泌的一种糖蛋白，是 Thl 细胞分泌的细胞因子之一，它在辅助性T细胞生长、增殖和分化的各个阶段都发挥重要作用[18]。IL-17在ACD效应期能诱导角质形成细胞产生多种炎性因子，调节趋化因子CXCL1及黏附分子ICAM-1表达，促进中性粒细胞活化和向炎症部位募集，加重局部炎性反应。

在评估一些药物治疗ACD的疗效时，通常使用的是接触性变态反应的动物模型，能简单快速地反映ACD的临床病理过程、筛选有效的治疗药物，其中DNFB建立小鼠耳廓 ACD 模型是目前学界最常用的动物模型之一[19]。DNFB是一种半抗原，将其稀释液涂抹腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7 d后再将其涂抹于耳部或足爪皮肤，使局部产生迟发型变态反应或称变应性接触性皮炎。

医用胶原蛋白在治疗ACD过程中可能抑制TH1细胞分泌IFN-γ而减少炎症细胞数量，其中以医用胶原蛋白低剂量和高剂量作用最强，而医用胶原蛋白中剂量与阳性对照药（地塞米松）较接近，3个剂量组均能减少炎症细胞数量，其中医用胶原蛋白中剂量可能存在延迟效应。医用胶原蛋白对血清中炎症因子IL-2的作用在本实验中表现不显著，但对血清中炎症因子TNF-α有抑制作用，而TNF-α主要由Th1细胞分泌，它在ACD的发病过程中发挥着促进炎性反应、改变血管内皮通透性、增加渗出等作用[20]。因此医用胶原蛋白对变应性接触性皮炎的治疗作用，可能与调节血清中TNF-α有关。

本研究组还发现，医用胶原蛋白对二甲苯致小鼠耳廓肿胀和鸡蛋清致大鼠足肿胀均有抑制作用，对热板致小鼠足部疼痛有止痛作用，支撑了医用胶原蛋白可抑制和缓解红肿热痛的临床应用，此研究内容尚未发表。

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