纯化水微生物限度检测法的优化

孙琳琳++++++王海亮++++++刘益明++++++卢会芬++++++吴国强

[摘要] 目的 建立更为科学合理的纯化水微生物限度检测法。 方法 采用薄膜过滤法，检验量分别为1 mL和10 mL，培养基分别选用营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、平板计数琼脂、R2A培养基，对纯化水样进行微生物限度检查。 结果 采用10 mL薄膜过滤法，R2A平板培养基进行纯化水的微生物限度检查，菌体检出率高于其他方法1～2倍，菌落培养效果好。 结论 确认了最优化的检验量和检验用培养基，建立了能更准确反映纯化水质量的检测方法。该研究有利于纯化水检测方法的改进和纯化水质量控制水平的提高。

[关键词] 纯化水；微生物限度检查；薄膜过滤法；检验量

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0004-03

[Abstract] Objective To establish a more scientific and reasonable purified water microbial limit test method. Methods Membrane filtration method （sample quantity： 1 mL and 10 mL） were used to do the test， and nutrient agar， rose bengal agar medium， plate count agar and R2A medium were used to demonstrate the microbiology separately. Results Membrane filtration method （sample quantity： 10 mL） and R2A were better than the routine method and the other medium with a much higher occurrence of total aerobic plate count. The detection rate was 1-2 times higher than the rate of other method and medium. Conclusion The selected testing sample quantity and culture medium are optimal， and the optimized test method will reflect the real quality of the purified water. The study will provide support for the testing improvement and quality control level.

[Key words] Purified water； Microbial limit test； Membrane filtration method； Sample quantity

《中国药典》2010版、2015版纯化水微生物限度检查中要求使用薄膜过滤法进行检查[1-2]，但未对薄膜过滤法的检测量等进行明确规定。目前常被采用薄膜过滤法检验量1 mL。已有研究表明，薄膜过滤法1 mL和平板计数法1 mL两种方法的检测结果一致，无明显差异[3]，可见采用1 mL检验量并不能体现薄膜过滤法的优势。故薄膜过滤法1 mL的检测方法符合性、严谨性不够。

《欧洲药典》[4-5]、《美国药典》[6-7]和《英国药典》[8-9]对纯化水检测方法有不同的规定和侧重点。目前，大部分出口欧美市场的制药企业，均会按照目标出口国的国家药典要求进行纯化水检测，但对于这些检测方法的样品检验量，国内未见研究[10]。

本试验在分析2010～2012年三个年度纯化水微生物限度检测报告的基础上，拟以自制纯化水为研究对象，基于中国和欧美药典的方法，对比研究了不同方法和培养基的检测效果，明确了最佳检验量，同时明确了更灵敏的培养基，建立了更科学的纯化水检测方法。该方法的建立对于提高纯化水微生物限度检查的有效性、真实性和简便性具有重要的现实意义，并与国际标准接轨。

1 材料和设备

1.1 材料

纯化水（石家庄以岭药业股份有限公司）。

1.2 试剂及培养基

氯化钠（天津大茂化学试剂厂）；磷酸二氢钾（天津科密欧化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（天津博迪化学试剂厂）；蛋白胨培养基（北京三药科技开发公司）；营养琼脂培养基（缩写NA，北京三药科技开发公司）；玫瑰红钠琼脂培养基（缩写RBA，北京三药科技开发公司）；平板计数琼脂培养基（缩写PCA，青岛海博生物技術公司）；酵母蛋白胨葡萄糖琼脂培养基（缩写R2A，青岛海博生物技术公司，德国默克）。

1.3 设备

TW-STV3A型薄膜过滤器（瑞安市图班生物技术设备），XGL.GWX-0.36B型脉动真空蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械），FD240型干热灭菌烘箱（德国宾德），S20K型pH计（梅特勒-托利多仪器），PL202-S型电子天平（梅特勒-托利多仪器），AVC-4A1型垂直净化工作台（安斯克生物技术设备公司，ESCO），BD240型恒温培养箱（德国宾德）。

2 实验方法

2.1 检验量的对比研究

分别取1 mL和10 mL的纯化水，采用《中国药典》2015年版（CP2015）四部中的薄膜过滤法进行其微生物限度检查[2]。

取少量pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液注入过滤杯中，以湿润滤膜。湿润滤膜后取10 mL或1 mL纯化水样及20～30 mL的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，过滤，取出滤膜，薄膜菌面朝上，分别置于营养琼脂培养基和玫瑰红钠营养琼脂培养基表面，细菌35℃，培养3 d，霉菌/酵母菌23℃，培养5 d[2]（作者已按照企业操作规程对该方法进行方法学验证）。菌落计数器计数。

2.2 培养基检测效力的对比研究

采用《美国药典》USP-38（USP38）、《欧洲药典》EP7.0（EP7.0）、《英国药典》BP2015（BP2015）和CP2015中规定的薄膜过滤法[4，6，8]，设定检测量为10 mL，分别使用营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、平板计数琼脂培养基PCA和R2A培养基进行检测培养。具体操作方法同“2.1”项下方法，取滤过后薄膜，分别置于营养琼脂培养基、玫瑰红钠营养琼脂培养基、平板计数培养基和R2A琼脂培养基的平板表面进行培养，计数。

3 实验结果

3.1 检验量对比研究的实验结果

不同检测量的纯化水微生物检测结果见表1。通过实验可以看出，对于1 mL检验量的薄膜过滤法，19个水点的微生物限度质量均良好，只有2个水点检测出微生物污染，且菌落数少，检出率低（2/19），未发现任何不良趋势。对于10 mL检验量的薄膜过滤法，菌体检出率较高（7/19），是1 mL检验量时菌体检出率的3.5倍，5、10、15、18和19号水点均反映轻微微生物侵染，能够更好地反映纯化水的微生物限度情况。13号水点微生物污染程度接近警戒线，便于发现不良趋势，及时采取针对纯化水系统清洁维护的整改措施。可见，薄膜过滤法具有较好的集菌效果，10 mL的纯化水检测量适合于纯化水的微生物限度检查，样本代表性较好，菌体检出率高，能够更加准确和真实地反映纯化水质量，保证纯化水系统的持续、稳定、有效运行。

3.2 培养基培养效力对比研究的实验结果

使用不同培养基进行微生物限度检测的实验结果，见表2。通过以上实验可以看出，对于相同样本，使用营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基平板检测和使用PCA培养基平板检测的微生物检出率较低（前者共有21个水点未检出菌体，后者共有18个水点未检出菌体），检出情况基本一致，差异量均≤1 cfu/10 mL。并且使用营养琼脂与玫瑰红钠琼脂培养基检测需要制备两张滤膜，工作量较大。而采用R2A琼脂进行菌落计数，操作相对简单，每个水点只需要制备一张滤膜即可，并且菌体检出率较高，共计14个水点微生物限度检出（结果均<3 cfu/mL），每个水点的菌体检出量均较多，最大差异量体现在：0622-08样品，R2A培养基（检出量21 cfu/10 mL）高于营养琼脂和玫瑰红钠琼脂（检出量10 cfu/10 mL）约1倍；0622-19样品，R2A培养基（15 cfu/10 mL）高于营养琼脂和玫瑰红钠琼脂（5 cfu/10 mL）约2倍。可见，R2A琼脂培养基具有较高的灵敏性，更适合于纯化水中微生物限度的检测。

4 讨论

USP、EP、BP和CP中均规定采用薄膜过滤法进行纯化水微生物限度检查，但对于纯化水的检验量都未明确规定，要求各单位根据实际用水情况和所安装纯水系统性能自定检验量[10]。纯化水水质是决定检验量的基础，通过本文的系统实验表明当前大多企业为追求操作简单只选定1 mL作为检验量是有所局限的，这个量并不能真实反映纯化水的质量，也不利于纯化水系统的监测和维护。

纯化水微生物限度年度质量回顾和趋势分析是确定检验量的重要依据，本研究基于石家庄以岭药业股份有限公司3年来大量的纯化水分析数据，找到了较合适的检验量，供读者参考应用。

实验中发现使用营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基的培养效果与使用PCA培养基的培养效果基本一致，可能只检出了水样含菌总数的一部分，未能完全反映水样中微生物的存在情况，这与顾孔珍等[11]的报道一致。R2A培养基属于低营养类培养基，其营养成分较广泛，能促进受损细菌的恢复性再生长，更适用于纯化水的检测。这将避免由于培养基灵敏度不够而造成的纯化水质量不良趋势无法被发现的情况，能够及时准确地反映纯化水系统运行情况，及时维护，延长系统寿命。

本文研究所确定的方法可大大提高纯化水微生物限度检测的有效性，有利于生产和检验中纯化水质量的控制。同时，也为其他制药企业建立合适的纯化水微生物限度法提供参考和指导。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：78.

[2] 国家药典委员会.中国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：579.

[3] 陈力奋，刘建国，屈晓萍，等.用平皿法检测纯化水的微生物限度[J].海峡药学，2006，18（1）： 88-89.

[4] 欧洲药典委员会.欧洲药典7.0[S].2013：3561.

[5] 欧洲药典委员会.欧洲药典8.0[S].2016：3561.

[6] 美国药典委员会.美国药典38[S].2015：1231.

[7] 美国药典委员会.美国药典39[S].2016：1231.

[8] 英国药典委员会.英国药典2015[S].2015：各论0008.

[9] 英国药典委员会.英国药典2016[S].2016：各论0008.

[10] 张杰.纯化水系统的微生物控制方法研究[J].医师在线，2015，2（17）：400.

[11] 顾孔珍，钱纯，罗岳平，等.用R2A培养基提高饮用水中細菌总数检出率[J].净水术，2004，23（1）：44-46.