双超法提取中药黄芩有效成分的研究

王羡一，李瑞海，贾天柱

双超法提取中药黄芩有效成分的研究

王羡一，李瑞海*，贾天柱

目的 利用高能超声破碎法和超滤膜获得黄芩中较高纯度的总黄酮成分。方法 以黄芩中黄芩苷化合物为对照品，采用紫外-可见分光光度法进行含量测定。对比超声、微波、回流和高能超声破碎提取法，并利用正交试验，以时间、乙醇浓度、料液比和次数4个因素进行考察，采用Biomax-5膜进行超滤膜分离。结果 单因素试验中以高能超声破碎提取法提取含量较高。正交试验结果：时间5 min，乙醇浓度为50%，料液比1∶10，提取3次。超滤膜分离条件:以流量为1.5 L/min、压力为0.8 kg进行膜分离。结论 高能超声破碎法和超滤膜的结合，用于黄芩中黄酮类化合物的纯化，方法可行，产品纯度高，方法具有良好的应用前景。

黄芩；黄酮；正交试验；高能超声破碎法；超滤膜

0 引言

目前,中药有效成分提取纯化的方法包括有机溶剂提取，有机溶剂反复萃取，利用柱层析分离等，但这些方法操作相对复杂，有效成分在整个操作中经常发生变化。高能超声破碎法是利用高能超声波将植物药的细胞破碎，进而获得更多有效成分的方法。中药的有效成分一般认为是存在于细胞内部或细胞间质当中，由于高能超声破碎法的细胞破碎作用，提取药物的有效成分相对完全，同时提取的过程不用加热，不破坏有效成分，具有良好的应用前景。超滤膜技术是利用物质分子的大小进行筛分分离，在生产中可以进行纯化、浓缩等过程，具有不耗能、产品收率高等特点。

虽然高能超声破碎法具有提取成分比较多的优点，但杂质相对也较多，而超滤法具有纯化成分的良好作用，因此，本实验拟将两个方法的优势结合起来，对黄芩中黄酮类化合物进行纯化方法具有实际意义。

黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，主要生物活性成分是以黄芩苷为主的黄酮类化合物。本实验采用紫外-可见分光光度法，采用正交试验法对黄芩高能超声破碎法提取的最优工艺进行研究，并将最优工艺提取的黄芩粗总黄酮，利用超滤膜进行进一步的纯化，以此获得高纯度黄芩总黄酮类化合物，为黄芩成分的进一步研究奠定基础。

1 仪器、试剂与试药

P230II UV230II紫外检测器，EC2006-色谱数据处理工作站(大连依利特)；M1-211A美的微波炉，微波功率：700 W；ESB-500高剪切均质乳化机(上海易勒机电实验室)；BIOQ-UNR-D3-2010小型膜分离系统，膜名称Biomax-5，分子量5 000(上海汇合堂生物工程设备有限公司)；0.000 01 g电子天平(SARTORIUS CP225D)；JD050T超声波提取器(奥特赛恩斯仪器有限公司)。黄芩苷(批号:20150726，购于中国药品生物制品检定所，大连美仑生物技术有限公司提供，纯度>99%)；黄芩产地河北，购买日期20150628，经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定均为为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根；实验用水为重蒸馏水，甲醇、乙醇等试剂为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 黄芩中黄芩苷类成分含量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定对照品加甲醇，制成黄芩苷0.007 mg/mL的对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取黄芩样品，粉碎，过100目筛，精密称取0.01 g，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，称定，补足重量，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.3 检测波长的确定[1]取黄芩苷对照品溶液，于紫外检测器上，在200～400 nm波长范围内进行扫描并测定吸收曲线，见图1。结果表明，黄芩苷的最大吸收波长是278 nm。因此，将278 nm作为总黄酮的检测波长。

图1 黄芩苷对照品

2.1.4 标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的黄芩苷1.0 mg，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解稀释并定容至刻度，摇匀，得到储备液。精密吸取储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，摇匀，以60%乙醇为空白溶液，在278 nm处分别测定吸收度。以黄芩苷浓度(X)(mg/mL)为横坐标，吸收度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程及线性范围为，黄芩苷Y=50.607 X-0.000 9，r=0.999 6，说明样品在0.002～0.016 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.2 常见提取方法的比较[2-4]将黄芩粉碎，精密称取0.06 g置于锥形瓶中，加60%乙醇溶液20 mL，4份，分别按表1方法处理得干浸膏，按“2.1.3”项条件测定法，按“2.3.4”项标准曲线测定样品含量，实验结果见表1。

表1 常见提取方法的比较

2.2.1 超声提取 于超声波清洗仪中常温超声提取30 min，超声频率100 Hz，过滤，滤饼再重复提取2次，合并3次提取液，减压浓缩至干[3]。

2.2.2 微波提取 于微波炉高火下加热至刚沸腾时即停止加热,约1 min后再加热，反复多次，直至累积加热10 min，过滤，滤饼再重复提取2次，合并滤液，合并3次提取液，减压浓缩至干。

2.2.3 回流提取 于水浴中80 ℃左右回流提取，2 h后过滤，滤饼再重复提取2次，合并滤液，合并3次提取液，减压浓缩至干。

2.2.4 高能超声破碎提取 于高能超声破碎机中提取10 min，过滤，滤饼再重复提取2次，合并3次提取液，减压浓缩至干。由表1实验结果可见，提取的含量相对较高，因此对高能超声破碎的提取条件采用正交实验法进行进一步优化。

2.3 正交试验研究

2.3.1 正交试验优选高能超声破碎提取条件 通过预试验结果表明，高能超声破碎提取的主要影响因素为时间、溶剂浓度、料液比和次数等，因此,以时间等4个因素进行考察，每个因素3个水平，采用L9(34)正交试验优选提取工艺。因素水平见表2。以黄芩苷成分为对照品，对黄芩总量进行对比，优选提取工艺条件。正交试验结果见表3，方差分析见表4，因素水平相关图见图2。

由R值可知，各因素对总黄酮类成分提取的影响大小顺序为D>B>C>A；方差分析结果D、B、C乙醇浓度、料液比、次数具有显著影响。最后确定提取工艺为A1B2C1D3，即时间5 min，乙醇浓度为50%，料液比1∶10，提取3次。

表2 黄芩黄芩苷类成分提取工艺优选正交试验因素水平

表3 黄芩总黄酮类成分提取工艺优选正交试验表及 含测结果

图2 因素指标相关图

2.3.2 正交优化工艺条件重复性实验结果 按优选的提取工艺提取3批黄芩总黄酮量，测定其含量，结果含量为501.01 mg/g(n=3，每g干膏)。

2.4 超滤膜分离条件的确定 取黄芩50 g，按上述正交实验得出的最佳提取工艺进行提取，提取液过滤，备用。

2.4.1 流量和压力的确定 在膜分离中，流量和压力是影响分离的主要因素，流量大，分离效率高，但相应压力也变大，会影响膜分离的效果和膜的使用寿命，取得一个适当的流量和压力平衡点，是膜分离操作的关键。取黄芩提取液于膜分离中，变换不同的流量，记录对应的压力，结果见图3，结果随着流量的提高，压力随之升高，但达到1.5 L/min时，压力急剧上升，最后选用1.5 L/min作为流量。

图3 流量和压力的关系

2.4.2 超滤膜分离时间的确定 分别于0.5、1、1.5、2、4 h测定膜分离浓缩液(主要为黄芩当中的杂质成分)中黄芩的含量，结果见图4，结果表明，在上述流量下进行的膜分离，在达到2 h后浓缩液当中黄芩苷总量已很少，因此最后确定膜分离时间为2 h。

图4 流量和总黄酮量的关系

表4 方差分析结果F 0.05(2.2)=19.00

2.4.3 超滤膜分离条件结果[5]超滤膜，原装美国进口，Biomax-5(0.1平方米盒式平板膜的盒式平板膜)，以蠕动泵，流量为1.5 L/min，压力为0.8 kg左右进行分离，约2 h完成。

2.5 纯化黄芩黄酮成分的含量测定结果 将黄芩50 g，加50%乙醇10倍，时间5 min，滤过，同法再提取2次，合并药液，按“2.4.3”项下方法进行膜分离。得滤液，浓缩，减压干燥，得干浸膏。精密称取0.5 mg，按“2.1.2”项下从“置具塞锥形瓶中”后方法处理，按“2.1.3”项条件测定法，在200～400 nm波长范围内进行扫描并测定吸收曲线，见图5，按“2.3.4”项标准曲线测定样品含量，其含量结果为812.73 mg/g(n=3，每g干膏)。

图5 高能超声破碎法结合超滤法样品

3 讨论

3.1 预试验中首先对提取溶剂选择 经查阅文献[6-10]，发现黄芩苷类成分一般采用甲醇和乙醇提取，经比较甲醇和乙醇的提取中两者并无著差异，与甲醇相比，乙醇的毒性较低，最后确定乙醇为提取溶剂，在对比不同浓度的乙醇提取发现，40%乙醇和乙醇(即低浓度乙醇和高浓度乙醇)提取，含量均低，最后确定50%、60%和70%甲醇作为提取浓度水平。预试验中发现，高能超声破碎提取时间长，提取完全，但超过15 min后，没有太大的变化。料液比对于提取有很大影响，预试验中发现，料液比1∶30时，含量不再增加。预试验中发现，温度对于高能超声破碎提取并没有太大影响，因此本次实验不作考察。最后确定高能超声破碎时间、乙醇浓度、料液比和次数4个因素，每个因素3个水平进行考察。

3.2 由表2 R值可知，各因素对黄芩苷总量类成分提取的影响大小顺序为D>B>C>A；以R值最小的A时间为误差项进行方差分析，结果乙醇浓度、料液比、次数等因素对黄酮提取具有显著影响，因此，选择其相应的最高水平。方差分析结果表明，时间不是影响实验的主要因素，因此，可选择利于生产的相关水平，即5 min。故确定提取工艺为A1B2C1D3，即时间5 min，乙醇浓度为50%，料液比1∶10，提取3次。

3.3 由表1常见提取方法的比较结果可知，微波提取、回流提取和均质提取法其含量都较高，超声提取法提取成分的含量较低。由于回流提取较为传统，可靠，但操作繁琐也是其主要的问题。与微波提取法相比，高能超声破碎提取法更具有优势，它减少了粉碎的环节，提取率相对较高，因此，本研究主要针对高能超声破碎提取法对黄芩进行研究，以利其在实验和生产中广泛应用。

3.4 由实验结果可知，高能超声破碎提取法可以更有效地将药物的有效成分提取出来，而且提取的过程不用加热，操作相对简单，所以有效成分不会像传统的回流等提取法那样受到温度的影响，这是高能超声破碎提取法的优势。同时本实验将高能超声破碎所得的提取液，利用超滤膜分离方法纯化，膜分离过程具有无相变发生，能耗低，无需外加物质，对环境无二次污染等特点，杂质去除较完全，获得了纯度较高的黄芩黄酮类化合物，两者结合应用，具有创新性，值得推广。

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Ultrasonic emulsification combined with membrane for extraction of flavonoids ingredients inScutellariabaicalensis

WANG Xian-yi,LI Rui-hai*,JIA Tian-zhu

(School of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To obtain high purity flavonoids ingredients ofScutellariabaicalensisGeorgi using the method of ultrasonic emulsification and membrane separation.Methods The content of Baicalin inScutellariabaicalensiswas determined by UV visible spectrophotometry.Compare ultrasound,microwave,reflux and ultrasonic emulsification method;and orthogonal experiment was used to investigate the 4 factors:ultrasonic emulsification time,ethanol concentration,solid-liquid ratio and times.Biomax-5 membrane was used to make ultrafiltration membrane separation.Results In the single factor experiment,the extraction rate of ultrasonic emulsification extraction was higher.Orthogonal test results showed the ultrasonic emulsification time was 5 min,ethanol concentration was 50%,the solid liquid ratio:1∶20,extraction:3 times.Membrane separation conditions:the membrane separation was done at a flow rate of 1.5 L/min and ultrafiltration membrane pressure of 0.8 kg.Conclusion The combination of ultrasonic emulsification and membrane can be used for the purification of flavonoids in Scutellaria baicalensis.The method is feasible,the purity of the product is high,and the method has a good application prospect.

Scutellariabaicalensis;Flavonoids;Orthogonal test;Ultrasonic emulsification;Ultrafiltration embrane

2016-11-17

辽宁中医药大学药学院，大连 116600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707024