屋尘螨提取液对哮喘气道上皮细胞间质转化的影响

穆 丹，陈荣娟

屋尘螨提取液对哮喘气道上皮细胞间质转化的影响

穆 丹*，陈荣娟

目的 探究屋尘螨提取液(House dust mite extracets，HDM)对人支气管上皮16-HBE细胞间质转化(Epithelia-mesenchymal transition，EMT)的影响。方法 以16-HBE细胞株为研究对象，分别加入HDM和转化生长因子β1 (Transforming growth factor-β1，TGF-β1)，应用MTT法和Western blot法，检测细胞增殖情况以及EMT过程中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。结果 ①HDM刺激后，16-HBE细胞形态改变不显著，同时对细胞增殖无显著影响；与TGF-β1联合作用后，细胞形态发生EMT变化，并且显著促进细胞增殖(P<0.05)。②HDM刺激对16-HBE细胞中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达均无显著影响；与TGF-β1联合作用后，E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)，Vimentin和α-SMA蛋白表达升高(P<0.05)，效果较TGF-β1单独应用更为明显。结论 HDM不能直接刺激上皮细胞发生EMT改变，但可通过促进TGF-β1诱导的上皮细胞EMT改变而发挥作用。

屋尘螨提取液；哮喘；气道上皮细胞；间质转化；转化生长因子β1

0 引言

支气管哮喘(简称哮喘)是一种严重危害人类健康的常见病，以气道炎症、气道高反应性和气道重塑为主要特点，其中气道重塑最为重要，其与哮喘严重程度密切相关，同时也是哮喘气道病理改变的基础[1-2]。近年研究发现，气道重塑可能与转化生长因子β1 (Transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导支气管上皮细胞间质转化(Epithelia-mesenchymal transition，EMT)有关，进而出现气道上皮细胞特征性E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达减少，而间充质细胞特征性α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)等表达增加的现象[3-5]。目前，参与哮喘气道EMT激活的关键机制尚不明确，因此，探讨EMT的病理机制，对于阻抑气道重塑的发生和发展具有重要的意义。屋尘螨提取物(House dust mite extracets，HDM)是一种引起哮喘的重要致敏原，被广泛用于构建动物哮喘模型。已有研究发现，采用HDM构建大鼠哮喘气道重塑模型时出现上皮EMT，提示HDM在体内可诱导气道重塑[6-7]。然而，由于体内环境受神经体液调节等多种因素的影响，体内实验并不能证实HDM可直接诱发上皮细胞EMT。因此，本实验通过体外观察HDM对正常人体支气管上皮细胞株16-HBE的影响，旨在进一步明确HDM是否参与TGF-β1诱导的EMT的发生。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器 正常人支气管上皮细胞株16-HBE购自中国科学院上海细胞库；MTT、HDM购自美国Sigma公司；兔抗人α-SMA抗体、鼠抗人Vimentin单抗、鼠抗人E-cadherin单抗和兔抗人β-actin单抗、辣根过氧化物酶结合的二抗均购自美国SantaCruz公司；高糖型DMEM培养基、二甲基亚砜均购于HyClone公司，胎牛血清购自Gibco公司；CO2细胞培养箱和全波长酶标仪购自Thermo Fisher公司；倒置光学显微镜(奥林巴斯CKX-41)购自日本奥林巴斯株式会社。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与细胞形态变化 正常人支气管上皮细胞株16-HBE在含10%胎牛血清、终浓度分别为100 IU/mL和100 μg/mL的青链霉素的高糖型DMEM培养基中培养，培养环境为37 ℃及5% CO2。当细胞超过85%时弃去培养基，0.05%胰酶消化并收集细胞，离心，沉淀，按1∶1比例接种传代。当细胞传至第3代，细胞生长至80%融合率时，以含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液同步化24 h，分为：①空白培养基对照组；②10 μg/L HDM组；③10 μg/L TGF-β1组；④联合组：HDM (10 μg/L)+TGF-β1 (10 μg/L)，实验浓度通过查阅相关文献确定[8]。各组细胞在相应药物处理后，培养72 h，倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力 取对数生长期的16-HBE细胞，将细胞数调整为5×104/mL，接种于96孔板中，实验按24 h、48 h、72 h分组，各时间组按“1.2.1”项下进行分组处理，每组设4个复孔，置于培养箱中培养24 h。各组于培养结束前4 h加入5 mg/mL MTT 20 μL，培养结束后弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，用酶标仪在490 nm下测定各孔OD值，计算细胞增殖率。

1.2.3 Western blot检测E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达 取对数生长期的16-HBE细胞，将细胞密度调整为2×106/mL，按每孔100 μL接种于96孔板中，按“1.2.1”项下进行分组处理，置于培养箱中培养72 h，收集细胞用PBS洗涤2次，加入1×SDS上样缓冲液300 μL，冰上放置30 min，超声裂解细胞，4 ℃、15 000 r/min条件下离心10 min，收集上清为细胞裂解液。用BCA法进行蛋白定量，10% SDA-PAGE垂直电泳分离，上样量为25 μg/孔，转移蛋白质到聚乙烯二氟膜上，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，1∶2 000倍稀释的兔抗人α-SMA抗体、1∶1 000倍稀释的鼠抗人Vimentin单抗、1∶1 000倍稀释的鼠抗人E-cadherin单抗、1∶4 000倍稀释的兔抗人β-actin单抗室温孵育1 h，加入1∶3 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的抗鼠或抗兔的二抗室温孵育1 h，用ECL发光系统进行显影，对条带进行半定量分析，以β-actin作为内参照，采用Gel-Pro Analysis图像分析软件测定条带吸光度，以(条带灰度×面积)/(内参照的灰度×面积)作为目的蛋白表达水平的参数，对产物相对定量。

2 结果

2.1 HDM对16-HBE细胞形态的影响 在倒置显微镜下观察各组16-HBE细胞，培养72 h后，对照组贴壁形成规则排列的单层细胞，呈立方形、小鹅卵石形或椭圆形上皮细胞形态，胞间连接紧密，具有典型的上皮细胞铺路石样特征(图1A)；HDM组部分细胞间黏附丢失，伸长呈梭形，细胞簇分散，少许丧失其原有铺路石样生长方式(图1B)；TGF-β1组部分细胞肥大，伸长呈梭形，细胞间隙增大，大量细胞游离并表现为纺锤体型的成纤维细胞样形态改变，丧失其原有铺路石样生长方式(图1C)；联合组细胞表现形态与TGF-β1组相似，较其更为明显(图1D)。

图1 各组16-HBE细胞形态情况(400×)注：A.对照组，B.HDM组，C.TGF-β1组，D.联合组

2.2 各组细胞增殖能力比较 与对照组相比，在0～72 h时，HDM组16-HBE细胞无明显的增殖效果(P>0.05)；48～72 h时，TGF-β1组16-HBE细胞有明显的增殖(P<0.05)；24～72 h时，联合组16-HBE细胞有明显的增殖(P<0.05)，并且作用时间越长，对16-HBE细胞增殖效果越明显。如表1所示。

表1 各组16-HBE细胞的增殖情况(n=4)

注：*与对照组比较，P<0.05

2.3 各组16-HBE细胞中E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表达情况 Western blot实验检测16-HBE细胞中E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表达情况，结果显示，与对照组相比，TGF-β1组、联合组E-cadherin蛋白表达均显著降低(P<0.05)，而Vimentin和α-SMA蛋白表达均显著升高(P<0.05)。HDM组中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图2、表2。

图2 各组16-HBE细胞中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达 表2 各组16-HBE细胞中E-cadherin、Vimentin和 α-SMA蛋白表达(n=4)

组别E-cadherin/β-actinVimentin/β-actinα-SMA/β-actin对照组0.92±0.140.35±0.090.24±0.06HDM组0.76±0.110.57±0.120.29±0.09TGF-β1组0.36±0.09*1.46±0.25*0.71±0.15*联合组0.11±0.03*1.58±0.24*0.86±0.13*

注：*与对照组比较，P<0.05

3 讨论

气道上皮细胞作为呼吸系统主要的屏障，其重塑过程在哮喘的发病机制中的作用逐渐引起人们的关注。研究显示，70%以上的难治性哮喘患者存在不同程度的气道重塑[9-11]。早期研究发现，成纤维细胞/肌成纤维母细胞的异常增多是气道重塑的关键[12]。近年来，EMT学说的提出为气道重塑的机制研究提出新的思路。EMT是指气道上皮细胞分化为间充质细胞的一种现象，主要表现为E-cadherin蛋白表达减少或丢失，导致上皮失去极性，进而获得间质细胞蛋白标记如Vimentin和α-SMA，出现浸润性和游走迁移能力，可作为肌纤维母细胞一个新的来源[13-14]。因此，有效抑制气道上皮细胞EMT改变可以作为治疗哮喘的重要靶点。

目前，作为重要的致纤维化因子，TGF-β1在气道重塑中的重要作用得到证实，其能诱导上皮细胞形态和生物学功能向间质细胞分化，从而参与气道纤维化而导致病理生理改变[15-16]。体外研究发现，损伤的气道上皮细胞分泌的TGF-β1较正常细胞显著提高；此外，亦有研究发现，哮喘患者气道壁内灌洗液的TGF-β1明显增高[17-18]。TGF-β1可能是以自分泌的方式来介导气道上皮细胞的EMT改变，其刺激能增加间充质标志物表达，同时下调上皮标志物表达，从而提高细胞的迁移能力，这种作用主要通过蛋白激酶，如 MAPKS、P38、ERK、JNK的转导来实现。本研究结果显示，TGF-β1组较对照组能明显促进16-HBE细胞增殖，当TGF-β1作用于16-HBE细胞72 h后，细胞发生典型的EMT改变，即细胞簇分散，细胞游离并转化成纺锤体型的成纤维细胞样形态，丧失其原有铺路石样生长方式。Western blot实验结果显示，TGF-β1组E-cadherin蛋白表达显著降低，而Vimentin和α-SMA蛋白表达均显著升高。研究结果与文献报道[19-20]一致，再次证实TGF-β1在气道重塑中具有重要作用。

HDM是引起哮喘发病的主要过敏原之一，由于其诱发的哮喘模型能够更好地反映人体的哮喘情况，因而备受关注。近年研究发现，HDM复制的哮喘动物模型中出现气道上皮发生EMT而参与哮喘气道重塑[21]。然而体内环境受神经体液调节等多种因素的影响，HDM在动物模型中与上皮细胞EMT发生的关系目前尚未形成定论。本研究结果显示，HDM组对16-HBE细胞无明显的增殖效果，并且当HDM作用于16-HBE细胞72 h后，细胞仍大致表现出规则的椭圆形上皮细胞形态，仅少许细胞游离并表现为纺锤体型的成纤维细胞样形态。Western blot实验结果显示，HDM组中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达等方面与对照组无显著性差异。提示HDM并不能直接刺激上皮细胞发生EMT改变。我们进一步对HDM和TGF-β1联合作用于16-HBE细胞进行观察，发现二者联合作用在对细胞的增殖效果、细胞形态的EMT改变以及E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白的表达均较TGF-β1单独作用更为明显，提示HDM可能通过促进TGF-β1诱导的上皮细胞EMT改变而发挥作用。

本研究表明，HDM并不能直接刺激气道上皮细胞发生EMT，只能间接通过TGF-β1诱导的上皮细胞EMT改变而发挥作用。当然，若要进一步明确HDM与TGF-β1诱导16-HBE细胞EMT之间的关系，尚需深入研究。

[1] Shimoda T,Obase Y,Kishikawa R,et al.Serum high-sensitivity C-reactive protein can be an airway inflammation predictor in bronchial asthma[J].Allergy Asthma Proc,2015,36(2):e23-e28.

[2] Rogala B,Bozek A,Gluck J,et al.Prevalence of IgE-mediated allergy and evaluation of Th1/Th2 cytokine profiles in patients with severe bronchial asthma[J].Postepy Dermatol Alergol,2015,32(4):274-280.

[3] Hosoki K,Kainuma K,Toda M,et al.Montelukast suppresses epithelial to mesenchymal transition of bronchial epithelial cells induced by eosinophils[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,449(3):351-356.

[4] Song L,Sen S,Sun Y,et al.Ketamine inhalation ameliorates ovalbumin-induced murine asthma by suppressing the epithelial-mesenchymal transition[J].Med Sci Monit,2016,22:2471-2483.

[5] Polimeni M,Gulino GR,Gazzano E,et al.Multi-walled carbon nanotubes directly induce epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells via the TGF-β-mediated Akt/GSK-3β/SNAIL-1 signalling pathway[J].Part Fibre Toxicol,2016,13(1):27.

[6] Calderón MA,Kleine-Tebbe J,Linneberg A,et al.House dust mite respiratory allergy:an overview of current therapeutic strategies[J].J Allergy Clin Immunol Pract,2015,3(6):843-855.

[7] De Alba J,Raemdonck K,Dekkak A,et al.House dust mite induces direct airway inflammation in vivo:implications for future disease therapy[J].Eur Respir J,2010,35(6):1377-1387.

[8] 岳喜磊,成莹,许继德,等.TRPC1在 TGF-β1诱导支气管上皮细胞间充质转化中的作用[J].中国病理生理杂志,2015,21(3):492-498.

[9] Tomei P,Masola V,Granata S,et al.Everolimus-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT) in bronchial/pulmonary cells:when the dosage does matter in transplantation[J].J Nephrol,2016,29(6):881-891.

[10]Milara J,Peiró T,Serrano A,et al.Roflumilast N-oxide inhibits bronchial epithelial to mesenchymal transition induced by cigarette smoke in smokers with COPD[J].Pulm Pharmacol Ther,2014,28(2):138-148.

[11]Nyabam S,Wang Z,Thibault T,et al.A novel regulatory role for tissue transglutaminase in epithelial-mesenchymal transition in cystic fibrosis[J].Biochim Biophys Acta,2016,1863(9):2234-2244.

[12]廖程程,陈亚红.上皮-间质转化在慢性呼吸系统疾病中的作用[J].生理科学进展,2013,44(3):216-219.

[13]Sung WJ,Park KS,Kwak SG,et al.Epithelial-mesenchymal transition in patients of pulmonary adenocarcinoma:correlation with cancer stem cell markers and prognosis[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(8):8997-9009.

[14]Hackett TL,Warner SM,Stefanowicz D,et al.Induction of epithelial-mesenchymal transition in primary airway epithelial cells from patients with asthma by transforming growth factor-beta1[J].Am J Respir Crit Care Med,2009,180(2):122-133.

[15]Beach JR,Hussey GS,Miller TE,et al.Myosin II isoform switching mediates invasiveness after TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(44):17991-17996.

[16]Sakimura S,Sugimachi K,Kurashige J,et al.The miR-506-induced epithelial-mesenchymal transition is involved in poor prognosis for patients with gastric cancer[J].Ann Surg Oncol,2015,22(Suppl 3):S1436-S1443.

[17]Ling KM,Sutanto EN,Iosifidis T,et al.Reduced transforming growth factor β1 (TGF-β1) in the repair of airway epithelial cells of children with asthma[J].Respirology,2016,21(7):1219-1226.

[18]刘永生,周发春.哮喘患者血清IL-13、TGF-β1、VEGF表达变化及与气道炎症、重塑的关系探讨[J].重庆医科大学学报,2012,37(10):880-883.

[19]张敏,徐军.MAPKs通路在转化生长因子β1诱导气道上皮细胞转化中的作用[J].中国呼吸与危重监护杂志,2007,6(6):440-443,插6.

[20]孙志宏,许文兵,朱元珏,等.干扰素γ抑制转化生长因子β1诱导的A549细胞上皮-间充质转化及对ERK1/2和STAT3的作用[J].国际呼吸杂志,2012,32(2):81-85.

[21]Post S,Nawijn MC,Hackett TL,et al.The composition of house dust mite is critical for mucosal barrier dysfunction and allergic sensitisation[J].Thorax,2012,67(6):488-495.

Effects of house dust mite extracts on epithelial-mesenchymal transition of asthmatic airway epithelial cells

MU Dan*,CHEN Rong-juan

(the 3rd Ward of Respiratory,Liaoyang Central Hospital,Liaoyang 111000,China)

Objective To explore the role of house dust mite extracts (HDM) in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human bronchial epithelial (16-HBE) cells.Methods Human bronchial epithelial cells (16-HBE) were treated with HDM and transforming growth factor-β1 (TGF-β1).After treatment for 72 h,the morphology and proliferation capacity of 16-HBE cells were investigated with light microscope and MTT method,and the expression of E-cadherin,Vimentin and α-SMA was tested by western blot.Results ①Treatment with HDM did not induce significant morphological change and proliferation of 16-HBE cells;HDM combined with TGF-β1 induced significant morphological changes and proliferation of 16HBE cells (P<0.05).②Treatment with HDM induced no significant change in E-cadherin,vimentin and α-SMA expression,but the expression of E-cadherin,vimentin and α-SMA changed significantly after the combination use of HDM and TGF-β1 (P<0.05).Conclusion HDM has no significant effect on EMT process of 16-HBE,but it can significantly enhance TGF-β1-induced EMT process.

House dust mite extracts;Asthma;Airway epithelial cell;Epithelial-mesenchymal transition;Transforming growth factor-β1

2016-11-09

辽阳市中心医院呼吸内三科，辽宁 辽阳 111000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707015