替米沙坦对高浓度葡萄糖引起的内皮细胞间质化的影响

孙 蓉，尚粉青

替米沙坦对高浓度葡萄糖引起的内皮细胞间质化的影响

孙 蓉1，尚粉青2*

目的 探讨替米沙坦对高浓度葡萄糖引起的内皮细胞间质化的影响。方法 采用体外分离培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为细胞模型，通过高浓度葡萄糖(30 mmol/L)诱导内皮细胞间质化，TGF-β抑制剂SB-431542或替米沙坦预处理内皮细胞6 h，然后用高浓度葡萄糖(30 mmol/L)孵育脐静脉内皮细胞48 h。RT-PCR和Western blot观察CD31、VE-cadherin、α-SMA和Vimentin表达变化。应用糖尿病小鼠模型验证上述指标的变化。结果 高浓度葡萄糖可以促进内皮细胞TGF-β的表达,而替米沙坦可抑制高浓度葡萄糖引起的TGF-β表达增加；高浓度葡萄糖可以降低内皮细胞CD31、VE-cadherin的表达，增加α-SMA及Vimentin的表达。TGF-β抑制剂SB-431542及替米沙坦可以显著逆转高浓度葡萄糖对内皮细胞间质化的影响。结论 替米沙坦可以降低TGF-β的表达，抑制高浓度葡萄糖诱导的内皮细胞间质化。

替米沙坦；高浓度葡萄糖；TGF-β；内皮细胞间质化

0 引言

心肌细胞纤维化是糖尿病心肌病发病过程中的重要机制，成纤维细胞激活、增殖是心肌纤维化过程中重要的病理过程。既往研究认为，成纤维细胞只由自身活化而来，近年来研究表明，成纤维细胞并非同质性细胞，而是一组高度异源的细胞群体，除由局部静止的成纤维细胞活化而来外，内皮细胞受到刺激后向间质成纤维细胞转化，即内皮细胞间质化(Endothelial-mesenchymal transition，EndMT)也是成纤维细胞的重要来源之一，在心肌纤维化过程中起重要作用。血小板-内皮细胞黏附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)和血管内皮钙黏蛋白(Vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)作为内皮细胞的特异分子，在EndMT过程中表达减少，而肌动蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)作为间质细胞特异性蛋白，在EndMT过程中表达明显增加。本文主要研究高浓度葡萄糖对EndMT的影响，并进一步明确其机制及替米沙坦的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物、试剂及仪器 替米沙坦购自勃林格殷格翰制药有限公司。葡萄糖、SB-431542购自Sigma公司。主要试剂：PCR引物，生工(上海)有限公司合成。β-actin抗体购自Santa Cruz公司；CD31抗体、VE-cadherin抗体、α-SMA抗体及Vimentin抗体均购自美国Abcam公司。蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂(德国Roche公司)，ECL发光液(Vazyme公司，Millipore公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，HiScriptTMqPCRSuperMix逆转录试剂盒、PCR DNA聚合酶(Vazyme公司)，其余试剂为国产分析纯。主要仪器：实时定量PCR仪及梯度PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，WB电泳仪和电泳槽、WB半干转膜槽(BIO-RAD公司)，自动洗片机(柯达公司)。

1.1.2 脐静脉内皮细胞的分离与培养 人脐静脉内皮细胞标本取自西安高新医院妇产科孕妇足月正常娩出的脐带组织。于无菌条件下获得新生儿脐带(长约15～20 cm，无破损，无钳夹痕迹)，置于冰的脐带保鲜液(M199培养基40%，100×AB/M溶液0.8%，1 mol/L HEPES溶液0.4%，肝素钠注射液0.144%)中，6 h内进行HUVECs分离。0.1%胶原酶灌注消化法分离HUVECs细胞。0.125%胰蛋白酶消化传代培养，取生长良好的第2～5代细胞用于实验。

1.1.3 动物实验方法 选用8～10周的SPF级雄性db/db和db/m小鼠(体重20 g左右,购于南京大学南京生物医药研究院)作为研究对象。20只8～10周的db/db小鼠(db/m小鼠8只作为对照组)，适应环境1周后测定空腹血糖。随机分为高糖组及替米沙坦组；替米沙坦组给予替米沙坦10 mg/(kg·d)每天灌胃治疗，db/db组和db/m组给予生理盐水。疗程8周，其中4周末、8周末测定空腹血糖。8周末血糖测定完毕后，CO2麻醉方法处死小鼠，取主动脉(升主动脉-主动脉弓-腹主动脉)，PBS冲洗，液氮快速冰冻，-80 ℃保存备用。所有试验操作已得到西安市第一医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 Western blot分析 内皮细胞经PBS洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上裂解20 min；液氮冻融3次，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，ABC法测定蛋白浓度。加入loading buffer，95 ℃,8 min蛋白变性。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(上层胶30 mA，30 min；下层胶50 mA，90 min)，转膜(230 mA，2 h)，5%脱脂牛奶(TTBS配制)封闭1 h，孵一抗4 ℃过夜，TTBS洗3遍，每遍5 min；孵二抗，室温1 h；ECL发光，自动洗片机洗片。标定Marker，进行扫描和分析。

1.2.2 Real time-PCR 六孔板每孔内皮细胞加入Trizol 1 mL，提取RNA。小鼠主动脉内皮细胞RNA提取采用Trizol 1 mL沿主动脉灌注，收集灌注液，提取RNA。采用紫外分光光度计检测浓度。取2 μg总RNA进行反转录(参照HiScriptTMqPCR SuperMix逆转录试剂盒说明书)。逆转录得到的cDNA进行实时定量PCR反应，反应体系参照TaqMan universal PCR Master Mix说明书。

2 结果

2.1 高浓度葡萄糖对EndMT的影响 不同浓度葡萄糖(5、10、30 mmol/L)孵育脐静脉内皮细胞48 h，RT-PCR结果提示，高浓度葡萄糖可显著增加内皮细胞TGF-β的表达，同时降低内皮细胞CD31、VE-cadherin的表达，增加α-SMA和Vimentin的表达。TGF-β抑制剂SB-431542(5 μmol/L)预处理内皮细胞6 h，然后以甘露醇(25 mmol/L)作为对照组，用高浓度葡萄糖(30 mmol/L)孵育脐静脉内皮细胞48 h。RT-PCR及Western blot检测结果均提示,高浓度葡萄糖可以降低内皮细胞CD31、VE-cadherin的表达，同时升高α-SMA及Vimentin表达，而SB-431542预处理内皮细胞可以显著逆转高浓度葡萄糖对内皮细胞CD31、VE-cadherin、α-SMA及Vimentin表达的影响。见图1、图2。

图1 高浓度葡萄糖对内皮细胞TGF-β表达的影响注：*与5 mmol/L组比较，P<0.05

图2 高浓度葡萄糖对EndMT的影响注：*与对照组比较，P<0.05；#与高糖组比较，P<0.05

2.2 替米沙坦对高浓度葡萄糖引起的EndMT的影响 替米沙坦(5 mmol/L)预处理内皮细胞6 h，然后用高浓度葡萄糖(30 mmol/L)孵育脐静脉内皮细胞48 h，RT-PCR结果显示，高浓度葡萄糖明显增加内皮细胞TGF-β的表达，而替米沙坦可显著降低高浓度葡萄糖引起的内皮细胞TGF-β表达的增加；RT-PCR及Western blot检测结果均提示，替米沙坦可以显著逆转高浓度葡萄糖对内皮细胞CD31、VE-cadherin、α-SMA及vimentin表达的影响。见图3。

2.3 db/db糖尿病模型小鼠主动脉内皮细胞各因子表达结果 与db/m小鼠相比，db/db小鼠主动脉内皮细胞TGF-β表达增加，CD31、VE-cadherin表达明显减少，而α-SMA及Vimentin表达明显增加。替米沙坦组TGF-β的表达较db/db小鼠降低，CD31、VE-cadherin表达明显增加，而α-SMA及Vimentin表达显著降低。见图4。

图3 替米沙坦对高浓度葡萄糖引起的EndMT的影响注：*与对照组比较P<0.05；#与高糖组比较，P<0.05

图4 糖尿病模型小鼠主动脉内皮细胞各因子表达结果注：与db/m组比较，*P<0.05,**P<0.01；与db/db组比较，#P<0.05

3 讨论

多因素诱导的EndMT是心肌细胞纤维化发展的重要机制之一[1-3]。高浓度葡萄糖能够促进人主动脉内皮细胞EndMT，损伤内皮细胞功能和动脉粥样硬化[4]。研究表明，血管紧张素Ⅱ可介导高浓度葡萄糖诱导的EndMT[5]。内皮素1和TGF-β可以诱导EndMT，而内皮素-1受体拮抗剂Macitentan可有效抑制EndMT[6]。有报道，内皮素1诱导的EndMT能够促进糖尿病小鼠心脏纤维化，基因敲除内皮素1能够减轻糖尿病小鼠心脏EndMT、纤维化及微血管减少。本研究表明，替米沙坦可以显著抑制高浓度葡萄糖诱导的EndMT。Tang等[7-8]研究结果表明，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂厄贝沙坦亦有此作用。

TGF-β在内皮细胞的EndMT中起重要作用。TGF-β可通过多种机制促进EndMT[9]。TGF-β通过上调Snail、β联蛋白、纤溶酶原激活剂抑制因子1和ATp300，下调p53，以及引起包含mir-125b和mir-21在内的多种miRNA表达失调促进EndMT。TGF-β也可通过Smad和非Smad路径促进Snail的表达[10]。研究表明，在脐静脉内皮细胞中，IL-1β和TGF-β2以NF-κB依赖的方式协同促进EndMT[11]。由此可见，TGF-β在EndMT过程中是多条信号传导通路的中心环节，有效抑制其表达有利于控制EndMT的发生和进展。松弛素可减轻TGF-β所诱发的内皮细胞EndMT，从而减轻心肌组织纤维化进程[12]。人组织激肽释放酶抑制蛋白可通过调节mir-21和内皮一氧化氮合酶的表达，抑制TGF-β所诱发的内皮细胞EndMT[13]。本实验证实了高浓度葡萄糖对内皮细胞的EndMT作用，并进一步证实高浓度葡萄糖可以通过TGF-β来诱导EndMT。替米沙坦可以通过降低TGF-β的表达，来抑制高浓度葡萄糖诱导的EndMT。

综上所述，对于糖尿病的治疗，无论是否合并高血压，应使用替米沙坦等药物治疗，这对于预防和治疗糖尿病心肌病的发生和发展具有重要意义。

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Effect of telmisartan on endothelial-mesenchymal transition induced by high-concentration glucose

SUN Rong1,SHANG Fen-qing2*

(1.Department of Emergency，Xi′an Gaoxin Hospital,Xi′an 710075,China;2.Cardiovascular Department,the First Hospital of Xi′an,Xi′an 710002,China)

Objective To investigate the effect of telmisartan on endothelial-mesenchymal transition induced by high-concentration glucose.Methods Endothelial cells were isolated from human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).High-concentration glucose (30 mmol/L) was used to induce the endothelial-mesenchymal transition.The endothelial cells were pretreated by TGF-β inhibitor SB-431542 (5 μmol/L) or telmisartan (5 mmol/L) for 6 h,and were co-cultured with high-concentration glucose (30 mmol/L) for 48 h.The changes of CD31,VE-cadherin,α-SMA and vimentin were determined by RT-PCR and Western blot.Diabetic mice model was used to verify the changes of the above indicators.Results High-concentration glucose could increase the expression of TGF-β,which could be reversed by telmisartan.High-concentration glucose could decrease the expression of CD31 and VE-cadherin,and increase the expression of α-SMA and vimentin.TGF-β inhibitor SB-431542 and telmisartan could significantly reverse the effects of high-concentration glucose on endothelial-mesenchymal transition.Conclusion Telmisartan can reduce the expression of TGF-β,and inhibit the endothelial-mesenchymal transition induced by high-concentration glucose.

Telmisartan；High-concentration glucose；TGF-β；Endothelial-mesenchymal transition

2016-10-20

1.西安高新医院急诊科,西安 710075；2.西安市第一医院心内科,西安 710002

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707014