辛伐他汀对脓毒症小鼠肺损伤的保护作用

杨文萍，孔冰冰，赵 欣，张 荣，王 煜

·论著·

辛伐他汀对脓毒症小鼠肺损伤的保护作用

杨文萍，孔冰冰，赵 欣，张 荣，王 煜*

目的 观察辛伐他丁对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用，并探讨其可能机制。方法 采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症小鼠模型，将72只雄性C57BL/6小鼠随机分成3组：假手术组、脓毒症急性肺损伤组(脓毒症组)、脓毒症+辛伐他汀治疗组(治疗组)。治疗组给予辛伐他汀0.2 μg/g，q12h腹腔注射1周；假手术组、脓毒症组给予等量安慰剂腹腔注射1周。分别于造模后6、12、24 h留取肺脏标本。HE 染色观察肺组织病理学变化，免疫组化检测肺组织toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)蛋白的表达，ELISA测定肺组织匀浆中IL-1β及TNF-α的表达水平。结果 与假手术组比较，造模后6、12、24 h，脓毒症组肺组织病理学评分、肺组织TLR4蛋白的表达，以及TNF-α、IL-1β水平明显升高(P<0.05)；与脓毒症组相比，治疗组上述指标明显降低(P<0.05)。结论 辛伐他汀通过抑制TLR4信号转导通路,减少其下游炎症介质TNF-α、IL-1β的释放,对脓毒症导致的急性肺损伤具有一定保护作用。

辛伐他汀；脓毒症；toll样受体4；TNF-α；IL-1β；急性肺损伤

0 引言

脓毒症是宿主对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能不全，是重症监护病房的主要死因。肺脏是脓毒症时最易受损伤的靶器官，急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)出现最早，且发生率最高[1]。Toll-like receptor 4(TLR4)在脓毒症所致肺损伤的病情发展中发挥重要作用，敲除TLR4基因或者靶向抑制TLR4的表达可以显著减轻ALI的程度[2-4]。近年研究表明，他汀类药物即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，具有独立于降血脂作用之外的抗炎、免疫调节、改善血管内皮细胞等多效性。本研究采用盲肠结扎穿刺术(Cecal ligation and puncture，CLP)法复制脓毒症大鼠模型，给予药物辛伐他汀干预，探讨辛伐他汀对脓毒症急性肺损伤的保护作用及可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂 健康SPF级C57BL/6成年雄性小鼠，体重：25～35 g。小鼠由我院本溪基地动物实验中心提供，动物检疫合格证号：SCXK(京)2014-0004。所有实验通过我院动物实验伦理委员会批准(伦理号：2015PS251K)。TLR4 Antibody购自美国Novus Biologicals公司，羊抗鼠免疫组化二抗试剂盒SP9002购自北京中杉金桥公生物技术公司，TNF-α 和IL-1β ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 小鼠脓毒症模型的制备 采用盲肠结扎穿孔法制备模型[5]。小鼠经5%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，采取前腹正中切口，沿前腹正中线作3 cm长的切口，从腹腔中取出盲肠,用5～0缝线结扎盲肠的50%(从盲肠游离端到结扎位置占盲肠全长的50%)。在盲端与结扎处的中点处，用18号针头由肠系膜侧无血管处向非肠系膜侧贯穿盲肠，避开盲肠血管。从穿孔的两端分别挤出少量粪便，然后将盲肠回纳入腹腔，逐层关腹。假手术组实验小鼠跳过盲肠结扎穿孔步骤，其他步骤与脓毒症组相同。

1.3 实验动物分组与处理 将C57BL/6成年雄性小鼠72只随机分为3组：假手术组、脓毒症急性肺损伤组(脓毒症组)、脓毒症+辛伐他汀治疗组(治疗组)，每组24只。分别于造模前1周开始进行预处理：治疗组给予辛伐他汀0.2 μg/g，间隔12 h，腹腔注射，共1周；假手术组、脓毒症组给予等量安慰剂0.02 mL/g，间隔12 h，腹腔注射，共1周。分别于造模后的6、12、24 h进行取材。

1.4 肺组织病理学观察 4%多聚甲醛固定小鼠肺组织，切割至厚度约0.5 cm组织块，常规组织梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、连续切片，行 HE 染色。光镜下观察肺组织病理学变化。综合肺泡水肿、间质水肿、肺泡内白细胞聚集数量、出血和肺泡壁厚度等采用肺损伤评分法评价肺损伤程度[6]。

1.5 肺组织TLR4蛋白的表达 肺组织TLR4蛋白检测采用SP法。石蜡包埋肺组织切成3.5 u切片，常规脱蜡，PBS漂洗，3%过氧化氢去离子水阻断内源性过氧化物酶活性。胰蛋白酶修复后，正常兔血清封闭非特异性抗原，滴加1∶500羊抗小鼠TLR4 抗体，4 ℃过夜。PBS漂洗后滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃温孵育30 min，PBS漂洗后DAB显色苏木素复染，脱水、透明、封片。阳性结果为呈环状分布的棕黄色或棕褐色颗粒，通过NIS-ElementSF 2.30图像采集软件进行图像采集,应用image-pro-plus软件测出阳性部分平均光密度值(OD值)。

1.6 ELISA法测定肺组织TNF-α 和IL-1β 肺组织放入预冷的匀浆介质(pH 7.4，0.01 mol/L，Tris-HCL 0.000 1 mol/L EDTA-2Na,0.01 mol/L蔗糖，0.8%氯化钠溶液)中研磨，4 ℃环境下制备肺组织匀浆。ELISA试剂盒测定小鼠肺组织TNF-α 和IL-1β含量，严格按使用说明书步骤进行操作。

2 结果

2.1 光镜下肺组织病理变化 假手术组小鼠肺脏无炎症损害改变；脓毒症组镜下肺间质可见大量炎症细胞浸润，其中以淋巴细胞和浆细胞为主，支气管周围可见淋巴细胞团分布，弥漫的支气管及肺泡扩张，肺泡相互融合。肺脏病理损害呈时间依赖性，其中以24 h肺脏损害最为明显；辛伐他汀治疗组可见淋巴细胞及浆细胞浸润明显减少，淋巴细胞团减少，甚至局部消失，支气管及肺泡扩张较前明显减轻，肺泡融合减少。见图1。与假手术组比，脓毒症组6 h、12 h和 24 h肺组织病理评分明显增高(P<0.05)；治疗组各时间点肺组织评分均较同期脓毒症组明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 三组小鼠不同时点肺组织病理学评分比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与脓毒症组比较，#P<0.05

2.2 肺组织TLR4蛋白的表达情况 TLR4为炎症信号转导通路重要介质，主要表达于肺泡细胞膜上，镜下观察阳性表达为棕色环形沉着颗粒，蓝色为苏木素染色的细胞核。镜下可见假手术组无棕色颗粒沉着，TLR4表达不明显；脓毒症组肺泡细胞膜棕色颗粒广泛均匀增多，且呈时间依赖性；治疗组镜下可见棕色颗粒明显减少。与假手术组比，脓毒症组6 h、12 h、24 h OD值均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与脓毒症比，治疗组12 h、24 h OD值明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2和表2。

图1 三组小鼠不同时点肺组织病理学变化(400×)

注：A.假手术组6 h;B.假手术组12 h;C.假手术组24 h;D.脓毒症组6 h;E.脓毒症组12 h;F.脓毒症组24 h;G.治疗组6 h;H.治疗组12 h;I.治疗组24 h。肺HE染色显示，肺间质有大量的炎症细胞浸润,广泛的支气管和肺泡扩张；任何时间点治疗组的肺损伤均较脓毒症组减轻

图2 三组小鼠不同时点肺组织TLR4蛋白的表达(400×)

注：A.假手术组6 h;B.假手术组12 h;C.假手术组24 h;D.脓毒症组6 h;E.脓毒症组12 h;F.脓毒症组24 h;G.治疗组6 h;H.治疗组12 h;I.治疗组24 h。免疫组化染色显示，任何时间点脓毒症组肺组织TLR4 蛋白表达均高于假手术组,假手术组的TLR4 蛋白表达均低于其他两组

表2 小鼠肺组织TLR4蛋白表达水平的OD值(n=7)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与脓毒症组比较，#P<0.05

2.3 肺组织TNF-α水平 与假手术组比较，脓毒症组6、12、24 h肺组织TNF-α水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，其中以脓毒症组12 h TNF-α 水平升高最显著；辛伐他丁治疗组各时点肺组织TNF-α水平较同期脓毒症组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 小鼠肺组织TNF-α表达水平(pg/mL，n=7)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与脓毒症组比较，#P<0.05

2.4 肺组织IL-1β水平 与假手术组比较，脓毒症组6 h、12 h、24 h肺组织IL-1β水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，其中以脓毒症组12 h IL-1β 水平升高最显著；辛伐他丁治疗组各时点肺组织IL-1β水平较同期脓毒症组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 小鼠肺组织IL-1β表达水平(ng/mL,n=7)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与脓毒症组比较，#P<0.05

3 讨论

脓毒症导致的急性肺损伤在临床中有很高的发生率和病死率，在抗感染治疗基础上，有效防治感染继发的肺损伤是降低脓毒症病死率的重要手段。动物实验研究发现，脓毒症导致的肺脏病理损害主要为炎症细胞的浸润、淋巴细胞团的形成、肺泡及支气管的扩张、肺泡相互融合等一系列炎症反应[7]。

Toll样受体家族是一类固有免疫受体，分布十分广泛，在淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞中具有很高的表达。其中，TLR4是toll样受体家族中的重要成员之一，属于Ⅰ类跨膜受体，分子结构由细胞外区、跨膜区和细胞内区组成。TLR4的细胞外区是识别脂多糖的重要结构，经过跨膜区及细胞内区将信息整合导入细胞内，使细胞内区域发生聚合活化反应，引起细胞内广泛的信号传导，使NF-κB以二聚体的活化形式转移进入细胞内，并与编码TNF-α及IL-1β基因的顺式元件结合，参与这些促炎因子基因的表达和调控[8]。脓毒症引起急性肺损伤的一系列过度炎症反应也正是通过TLR4通路的作用使肺泡巨噬细胞呈瀑布样释放TNF-α、IL-1β等促炎因子，最终导致急性呼吸窘迫综合征[9-10]。TNF-α 是脓毒症最早产生的多功能细胞因子，可以激活肺组织中的中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、内皮细胞和血小板，进一步诱导氧自由基、其他炎性因子及溶酶体酶的产生和释放，发挥“级联放大”的作用，直接损害肺血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型细胞，从而加重肺组织的损伤。炎症反应过程中TNF-α是始动因素，IL-1β起协同作用[11]。IL-1β不能直接活化炎性白细胞，但可以引起IL-8的分泌，通过改变前炎症介质或抗炎症细胞因子的表达和影响组织多形核中性粒细胞聚集而促进炎症的发展[12]。本实验发现，脓毒症大鼠6 h即出现肺组织TNF-α、IL-1β升高，12 h 达高峰，24 h稍下降。而辛伐他汀治疗组各时点肺组织TNF-α、IL-1β表达明显下降。脓毒症组镜下肺间质可见大量炎症细胞浸润，其中以淋巴细胞和浆细胞为主，弥漫的支气管及肺泡扩张，肺泡相互融合；辛伐他汀治疗组肺组织病理损伤明显减轻。辛伐他汀的作用机制可能是其抑制了脓毒症小鼠肺组织TLR4信号的激活,并由此减少了该信号通路下游炎症因子TNF-α和IL-1β的产生,能部分改善脓毒症所致的肺损伤。辛伐他汀是一种多靶点的肺损伤保护药物,有望为脓毒症的治疗提供新的靶点。

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Protective effects of simvastatin on lung injury of sepsis mice

YANG Wen-ping,KONG Bing-bing,ZHAO Xin,ZHANG Rong,WANG Yu*

(Emergency Department,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To explore the protective effect of simvastatin on sepsis-induced lung injury of mice and its possible mechanisms.Methods Totally 72 male C57BL/6 rats were randomly divided into sham group,sepsis group of acute lung injury(sepsis group) and cecal ligation and puncture operation (CLP)+ simvastatin (treatment group).Rat sepsis model was established by CLP.The mice in treatment group were intraperitoneally injected with simvastatin (0.2 μg/g,once per 12 hours) for a week;mice in sham group and sepsis group were given equal volume of placebo.The lung tissue specimens were gathered at 6,12 and 24 h after operation.Pathological changes of lung tissue were observed by HE staining;the contents of lung TNF-α and IL-1β were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA);the expression of TLR4 protein in lung tissues were detected by immunohistochemical method.Results The pathological scores of lung tissue,the expression of TLR4 protein and the levels of TNF-α and IL-1β in sepsis group were higher than those of sham group (P<0.05),and the above indexes in treatment group were lower than those of sepsis(P<0.05).Conclusion Simvastatin has certain protective effect on lung injury caused by sepsis.The effect may be mediated by the inhibition of TLR4 signal pathway by simvastatin and the consequent decrease of the generation of downstream inflammatory factors,such as TNF-αand IL-1β.

Simvastatin；Sepsis；Toll-like receptor 4；TNF-α;IL-1β；Acute lung injury

2017-03-14

中国医科大学附属盛京医院急诊科, 沈阳 110004

辽宁省自然科学基金项目(2015020527)

10.14053/j.cnki.ppcr.201707001

*通信作者