食品级纳米二氧化硅对小鼠器官功能影响的研究

刘嘉褀,候晓敏,彭子荷,刘和亮,郝小惠,*

(1.华北理工大学基础医学院医学实验技术专业,河北唐山 063000;2.华北理工大学公共卫生学院,河北唐山 063000;3.华北理工大学医学实验研究中心,河北唐山 063000;4.国家科技部老年医学国际科技合作基地,河北唐山 063000)



食品级纳米二氧化硅对小鼠器官功能影响的研究

刘嘉褀1,候晓敏2,彭子荷1,刘和亮3,4,郝小惠3,4,*

(1.华北理工大学基础医学院医学实验技术专业,河北唐山 063000;2.华北理工大学公共卫生学院,河北唐山 063000;3.华北理工大学医学实验研究中心,河北唐山 063000;4.国家科技部老年医学国际科技合作基地,河北唐山 063000)

目的:通过测定小鼠连续性口服食品级纳米二氧化硅(Nano silicon dioxide,Nano-SiO2)12周后血清及肝、肾、睾丸组织中硅元素的含量,并对小鼠肝肾等器官进行观察,初步评价纳米二氧化硅对机体的安全性。方法:将雄性昆明小鼠随机分为对照组(0.05%BSA)、纳米SiO2低剂量组(100 mg/kg/day)、中剂量组(500 mg/kg/day)、高剂量组(1000 mg/kg/day)和微米SiO2组(1000 mg/kg/day),各组按上述剂量分别连续灌胃二氧化硅84 d后全部处死,利用HE染色观察各组动物的肝脏、肾脏、睾丸等组织病理学变化;ICP-OES检测血清及肝、肾、睾丸组织中硅元素的含量;检测各组动物血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和尿素氮(BUN)的含量。结果:病理学观察在纳米低、中、高剂量组均发现肝脏、肾脏和睾丸组织有形态上的异常改变,以高剂量组更严重;纳米组血清中ALT、AST和BUN的含量均显著增高(p<0.01或p<0.05);同时在血清及肝、肾、睾丸组织中纳米组的硅离子含量增高并呈现剂量依赖性;上述指标中同等剂量纳米组和微米组相比,纳米组含量高且病理变化更明显。结论:较长时间口服摄入食品级纳米二氧化硅可能在机体的肝脏、肾脏、睾丸等脏器内蓄积,造成一定程度的肝脏、肾脏等的病理学损害并影响其功能。长期多量食入纳米二氧化硅可能会对机体造成不良影响。

食品添加剂,纳米二氧化硅,ICP-OES,谷草转氨酶,谷丙转氨酶

二氧化硅(SiO2)在我国乃至世界范围是一种广泛应用的食品添加剂,在食品中主要使用的是无定型二氧化硅,以E551的名字出现在各类食品的配料表上,是防止颗粒聚集结块、保持食品松散、自由流动的抗结剂[1-2]。随着生产工艺的发展,SiO2已经达到了纳米尺寸,在食品、药品、化妆品、农业等领域均有广泛的应用[3-4]。目前我国公民日常从食物中摄取的二氧化硅量未见相关的统计数据。但国外有文献报道人们每天从食物中摄取的二氧化硅约有9.4 mg/kg/day,其中估计有1.8 mg/kg/day是纳米范围的[5]。由于纳米颗粒的比表面积增大、表面反应基团数目增多,其生物活性也大大增加,因此,纳米材料的毒性和生物安全性成为人们关注的热点之一[6]。然而目前针对食品中纳米SiO2的研究较少。因此对食品级纳米SiO2的安全性评价与代谢研究是保证食品安全应做的重要工作。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

动物 无特定病原体(SPF)级健康雄性昆明小鼠40只[北京华阜康生物科技有限公司,许可证编号:SCXK(京)2014-0004],体质量18～22 g；R972型纳米二氧化硅(20～30 nm) 上海缘钛化工产品有限公司;LH-102型微米二氧化硅 天津市龙华化工有限公司;牛血清白蛋白 美国sigma公司;二氧化硅标准溶液(500μg/gNCS纳克公司;TirtonX-100 美国Amresco 公司;谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒、尿素氮(BUN)检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES) 美国PerkinElmer公司;iMARK680型酶标仪 美国BIO-RAD伯乐公司;Milli-Q10型超纯水机 美国Millipore公司;Q5000型微量紫外分光光度计 美国Eppendorf 公司;DP80图像采集系统 日本OLYMPUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与处理 将40只小鼠随机分为对照组、低剂量纳米SiO2组(100 mg/kg/day)、中剂量纳米SiO2组(500 mg/kg/day)、高剂量纳米SiO2组(1000 mg/kg/day)、微米SiO2组(1000 mg/kg/day)每组各8只[5]。高压超纯水配制质量浓度为0.05%的牛血清白蛋白溶液(BSA),用0.05%的BSA配制10、50、100 mg/mL的纳米SiO2,100 mg/mL的微米SiO2,每只小鼠按照上述分组根据体重给予相应体积的SiO2灌胃,对照组给予10 mg/kg/day的0.05%的BSA一次性灌胃,共持续84 d,并每天观察动物的生长状况、生活习性等一般性状。每周称量质量并按照该值调整各组动物的灌胃体积,于灌胃后第85 d经麻醉后处死全部动物。

1.2.2 标本的制备 各组小鼠分别抽取约0.8 mL抗凝血,4 ℃,12000 r/min,离心15 min后提取上清待用;分别取动物部分肝脏、肾脏、睾丸组织经4%甲醛固定后经过脱水、浸蜡、包埋制成石蜡切片进行病理组织学观察;其余上述组织置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.3 小鼠器官组织病理学观察 将制备好的小鼠肝脏、肾脏、睾丸等组织石蜡标本切片,常规脱蜡、水化后,进行苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色,用OLYMPUS光学显微镜组织切片成像系统观察小鼠各组织病理学结构并摄片。

1.2.4 小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量测定 按照试剂盒说明书步骤操作,分别将各组小鼠血清与相关试剂混匀,37 ℃水浴30 min后,于酶标仪510 nm波长处读取读数,同时绘制标准曲线,其中谷丙转氨酶公式为y=298.02x-2565.59(R2=0.9988);谷草转氨酶公式为y=3435.2x2-5.8098x-0.4749(R2=0.9996),根据标准曲线和测得的吸光度值计算出各样本的谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量,为卡门氏单位U。

1.2.5 小鼠血清尿素氮含量测定 按照试剂盒说明书将一定量样本中依次加入各试剂并混匀水浴后,用分光光度计在640 nm波长处测量出标准液和各样本的OD值,设空白对照调零。

尿素氮含量=待测样本的OD值/标准品OD值×标准浓度(10 μmol/L)×样品稀释倍数。

1.2.6 ICP-OES检测各组动物血清及肝、肾、睾丸组织中游离硅原子含量

1.2.6.1 ICP-OES工作条件 功率:1.30 kW;等离子气流:15.0 L/min;辅助气流量:1.50 L/min；进样时间:30 s;雾化器流量:0.70 L/min;稳定时间:15 s;清洗时间:10 s;观察高度:7 mm;蠕动泵转速:15 r/min;积分时间:5.00 s;积分次数:3。

1.2.6.2 样品处理 室温解冻血清,吹打至均匀,取0.4 mL血清用稀释液(1% HNO3加0.1% TirtonX-100)1∶20稀释后上机检测;准确称取0.20 g肝、肾及睾丸组织于微波消解罐中,加入消解液在微波消解仪中消化,用超纯水稀释后上机检测。

1.3 统计学分析

2 结果与分析

2.1 小鼠组织病理学观察

图1 各组小鼠肝脏、肾脏及睾丸组织切片观察(HE染色×400)Fig.1 The pathology observation of liver,kidney and testis of mice in each group by HE(×400)注:A:对照组;B:纳米低剂量组;C:纳米中剂量组;D:纳米高剂量组;E:微米组。

表1 各组小鼠血清ALT、AST和BUN检测结果Table 1 The results of ALT,AST and BUN in serum of mice in each ±s)

注:与对照组比较,a)p<0.05,b)p<0.01,;与微米SiO2组比较,c)p<0.05,d)p<0.01,表2同。2.1.1 小鼠肝脏组织病理学观察 对照组小鼠肝脏组织HE染色切片用高倍镜观察所见,肝小叶结构清晰,肝细胞排列成索条状,汇管区结构清晰,肝细胞大小均一,被膜光滑,中央静脉及肝血窦无扩张充血表现。纳米低、中、高剂量组均可见部分肝小叶中央静脉扩张充血、肝窦充血,肝细胞索尚呈放射状排列,在高剂量组汇管区可见小静脉扩张充血,肝细胞脂肪样变性,少数肝细胞的坏死。中央静脉周围间质可见成纤维细胞,微米组也可见上述扩张充血表现,与纳米低剂量组病变程度相当。

2.1.2 小鼠肾脏组织病理学观察 对照组小鼠肾脏组织皮质髓质清晰可辨,肾小球和肾小管边界清晰,近曲小管和远曲小管细胞特征明显,细胞排列整齐。纳米低剂量组的细胞可见肾脏背膜光滑,未见增厚,有少量肾小球体积增大,血管扩张充血,肾小球内皮细胞数目增多。肾小管未见异常病变,皮质厚度正常。中、高剂量纳米组小鼠肾小管可见轻微水变性,肾间质小血管扩张充血。微米组肾脏可见改变如同低剂量纳米组。

2.1.3 小鼠睾丸组织病理学观察 对照组小鼠睾丸组织腺管细胞排列整齐,腺腔内可见各级生精细胞层次分明,细胞数量多,成熟精子排列整齐清晰可辨。而纳米组的小鼠睾丸腺腔内腺管排列紊乱,腺腔内各级生精细胞排列紊乱、层次不清,极向紊乱,随着纳米剂量的增加,细胞紊乱程度增加。微米组的存在上述异常表现但较轻微。

2.2 小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量检测结果

表1中小鼠肝脏功能检测结果显示,纳米和微米SiO2组的谷丙转氨酶含量均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.05);其中纳米高剂量组增高最明显，是正常对照组的4.25倍,微米组的谷草转氨酶含量低于各纳米剂量组,差异有统计学意义(p<0.05)。表1中显示谷草转氨酶含量测定结果略不同于谷丙转氨酶,只有高剂量纳米SiO2组的该酶含量高于正常对照组,同时也高于微米SiO2组,差异均有统计学意义(p<0.05),其他各组间比较差异无统计学意义。

2.3 小鼠血清尿素氮含量检测结果

表1中各组小鼠血清尿素氮检测结果可见纳米SiO2各剂量组和微米组的尿素氮均高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.01或p<0.05);纳米组和微米组相比,中、高剂量纳米组的尿素氮检测结果高于微米组(p<0.01或p<0.05)。

2.4 ICP-OES检测小鼠血清及肝、肾、睾丸组织中硅含量结果

由表2可见,正常对照组小鼠血清硅含量均值为4.029 μg/mL,三个纳米SiO2组小鼠的血清硅含量均高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.01),其中以中剂量组含量最高,均值为5.961 μg/mL,大约高于正常对照组47.9%,微米SiO2组的硅含量略高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05);微米组与纳米组相比,中、高剂量纳米组血清硅含量高于微米组(p<0.01)。低剂量纳米组和微米组相比差异无统计学意义。

肝脏组织中硅含量测定结果显示,纳米低、中、高剂量组及微米组的硅含量均明显高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01);纳米高剂量组硅含量高于同剂量微米组,差异有统计学意义(p<0.01);低、中剂量纳米组和微米组相比差异无统计学意义。

表2 各组小鼠血清及肝、肾、睾丸组织中游离硅元素检测结果±s)Table 2 The results of free-Si in serum,liver,kidney and testis of mice in each ±s)

表2结果显示,纳米低、中、高剂量组及微米组的肾脏组织中硅含量均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01或p<0.05);微米组与纳米组相比,中、高剂量纳米组硅含量高于微米组(p<0.01)。低剂量纳米组和微米组相比差异无统计学意义。

由睾丸组织中硅含量测定结果可见,纳米低、中、高剂量组及微米组的硅含量均明显高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01);与微米组相比,纳米中、高剂量组硅含量均比微米组高,差异有统计学意义(p<0.01),纳米低剂量组含量低于微米组,差异有统计学意义(p<0.01)。

3 结论与讨论

有动物实验研究发现，经静脉或腹腔注射进入体内的纳米SiO2经血循环再分布后在肝脏和脾脏有较高的富集[7-9],而肺脏和肾脏的再分布量较少[10-11],Meike等[5]经连续口服给予大鼠低剂量的食品级纳米SiO228 d后观察到其在肝肾脾仅有少量的分布,而在空肠和回肠有大量的蓄积。但也有研究认为经口服后SiO2可在机体的肝肾等脏器蓄积,对于SiO2的生物安全性状研究表明,不同途径进入机体的纳米SiO2对肺脏、心血管系统、肝肾、胃肠、神经等组织器官均有不同程度的损害作用[12-14]。口服进入人体的纳米SiO2,首先与胃肠道粘膜接触产生作用,对胃肠道粘膜细胞有可能造成损害,关于这方面的文献寥寥无几,针对食品中的纳米SiO2的研究更少。另一方面,长期摄入是否对肝脾肾等器官造成损害也是值得明确的问题。目前对于食品级纳米SiO2的研究相对匮乏,因此日常食用的食品级纳米SiO2在体内分布情况及对重要脏器是否造成影响是此研究的核心问题。从纳米SiO2的特性和上述的研究现状出发,本实验选择小鼠作为实验对象,分别设计了高于我们日常摄入量约10、50和100倍的纳米SiO2经消化道连续饲养动物12周即84 d,同时应用等同于纳米SiO2高剂量的微米SiO2做对比,观察其对小鼠肝、肾等重要脏器是否有不良影响。

由结果可见,从病理切片组织学的角度观察肝脏的情况,与正常对照组小鼠相比,纳米组的肝组织出现肝细胞脂肪变性,肝小叶中央静脉和汇管区静脉扩张充血等表现,在纳米低剂量组即出现上述表现,中剂量组和高剂量组表现相似,没有肝细胞坏死、硬化等发生,但肝细胞脂肪变性的程度加深。而微米SiO2组的上述变化不很明显,只可见少数肝细胞的脂肪变性程度轻微,推测SiO2经血循环进入肝细胞,并对肝细胞产生一定的不良影响,纳米组的病变程度较微米组的为重,可能因为纳米颗粒细小,经胃肠道粘膜吸收入血进入肝脏的机会增多[3]。

肾脏的病理学表现也大致相同,纳米SiO2组的肾脏可见部分肾小球体积增大,血管扩张充血,间质内的细胞成分如血管内皮细胞增生,上述变化在各剂量纳米组均可见。在中高剂量组可见肾小管的轻微水变性,可见间质小血管的扩张充血。在微米组的变化如同纳米低剂量组的变化程度。

在实验过程中发现灌胃开始1周左右动物的睾丸有红肿现象,但随着灌胃时间的延长逐步消失,因此在组织病理学观察时特意对睾丸组织进行了观察,发现在纳米组的动物睾丸腺腔内腺管排列紊乱,腺腔内的各级生精细胞排列紊乱、层次不清,极向消失,成熟的精子数量减少,并且上述变化随着纳米剂量的增高而程度加深,而微米组上述的变化程度很轻微。黄遂[15]的研究发现纳米SiO2可通过调节凋亡信号通路上的关键蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平的变化而引起生殖损伤,另有文献报道通过气管内灌注纳米SiO2的方法发现长期接触可引起雄性小鼠的精子存活率下降、畸形率增加[16],本实验的睾丸病理学观察所见是上述结果的病理学印证。

这些病理变化的结果提示纳米SiO2可能更易通过胃肠道粘膜吸收入血,再分配到达肝脏,肾脏,睾丸等组织细胞当中,对上述器官产生一定程度的影响。但目前的观察并未发现上述器官出现硬化、增生甚至大量坏死等更加严重的形态学病变。

为进一步探究纳米级SiO2进入机体后对上述器官的功能是否产生不利的影响,我们观察了肝脏功能相关的指标即肝脏的谷丙转氨酶和谷草转氨酶以及肾脏的血清尿素氮的水平。肝脏的谷丙转氨酶检测结果显示,在纳米组的该值增高,在纳米高剂量组增高尤为明显,是正常对照组的4.25倍,而微米组增高后的水平与纳米低剂量组相当,与病理变化相一致。谷丙转氨酶主要体现的是肝细胞受损的程度,上述结果表明纳米SiO2进入肝脏对肝细胞功能造成影响,并与纳米SiO2的剂量相关。然而同时检测的谷草转氨酶则表明肝细胞坏死的状况,结果只有纳米中、高剂量组出现了具有统计学意义的增高,说明纳米SiO2进入肝脏主要引起细胞的变性,而无明显的细胞坏死。反映肾脏功能指标的血清尿素氮检测结果显示在纳米组尿素氮含量均显著增加,而微米SiO2组的该指标值较低,提示可能对肾脏功能产生一定程度的影响。

上述ALT、AST及BUN的结果提示纳米SiO2可能更容易穿过胃肠道的细胞膜被吸收并且可以随血流到达其他作用的靶器官,如肝脏、肾脏、睾丸等,并对其功能产生不良影响。Nishimori[17]等人研究显示70 nm的SiO2对小鼠肝脏有损伤,此外,还发现70 nm的SiO2对肝血清指标ALT、IL-6、TNF-α存在剂量效应,长期接触可以导致肝纤维化。Park[18]等研究表明,微米级SiO2只能到达细胞间质,而纳米SiO2可被吸收至细胞核中。赵光强[19]等采用透射电子显微镜观察不同粒径SiO2细胞内分布,纳米SiO2组细胞间质可见高电子密度纳米SiO2颗粒,部分膜不完整,而微米SiO2组细胞质内未发现高电子密度颗粒,膜结构完整。推测本实验结果可能与纳米SiO2粒径小易穿过细胞膜有关。相比之下相同剂量的微米SiO2上述血清生化指标及组织病理变化非常轻微可能主要是因为微米SiO2的粒径相对较大,不易穿过胃肠道的细胞膜而吸收少。

上述推测也被ICP-OES测得的血清及肝、肾、睾丸组织中游离硅含量变化进一步证实,该结果显示在血清及肝、肾、睾丸组织中,纳米SiO2的含量较微米SiO2含量明显增高,并且纳米SiO2含量与摄入量呈正相关关系。本实验研究是基于动物实验并且是高于可能的日常摄入量很多倍的实验结果,因此应该谨慎的解释和评价,关于相关的人群方面的研究,目前尚缺乏有力的证据[20],但我们在应用如食品添加剂纳米SiO2等诸如此类的纳米材料的同时应高度警惕其可能潜在的对人体的危害。

综上所述,食物中的纳米SiO2更易进入体内被机体吸收,并会对机体的重要脏器及其功能产生不良的影响,且影响的程度与摄入的量相关。本次实验结果是在高于人体正常摄入量很多倍的基础上得出的,而摄入多大剂量的纳米SiO2会对人体健康造成威胁还有待进一步的实验证实。

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Study on the effects of the food grade silica Nanoparticleson the organ function of the mice

LIU Jia-qi1,HOU Xiao-min2,PENG Zi-he1,LIU He-liang3,4,HAO Xiao-hui3,4,*

(1.Basic Medical College,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China;2.School of Public Health,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China;3.Medical Research Center,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China;4.International Science and Technology Cooperation Base of Geriatric Medicine of Ministry ofScience and Technology,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China)

Objective:To evaluate the safety of Nano silica on the tissues of the mice,the mice were taken oral administration with the food grade silica Nanoparticles(Nano silicon dioxide,Nano-SiO2),after 12 weeks the content of silica in serum,livers,kidneys and testis of silica were detected,and the livers and kidneys of mice were observed. Methods:Male KM mice were randomly divided into different groups including the control group(0.05%BSA),Nano-SiO2groups(100,500,1000 mg/kg/day)and micron-SiO2group(1000 mg/kg/day). 84 days later,all animals were killed and the tissues were collected. The histopathological changes of livers,kidneys,testis and other tissues of the mice by HE staining were obversed. Content of silicon in livers,kidneys,testis and serum were detected by ICP-OES. The content of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST)and blood urea nitrogen(BUN)in serum were measured by colorimetric method. Results:All the results were compared with the control group. The HE staining showed the varying differences of pathological changes in the livers,kidneys and testicular tissue abnormalities and the high dose of Nano-SiO2group was the most. With the increase of Nano-SiO2doses,the contents of ALT,AST and BUN were increased. The examination of the silicon in the livers,kidneys,testis and serum of the Nano groups were inhibited in dose-dependent manner. Compared with the same dose of micron group,the above results of the Nano group were more serious. Conclusion:Taking orally with food grade Nanosilicon for a long time,the poison may accumulate in the body's liver,kidney,testis and other tissues,leading to different histopathological damages and affect their functions.

food additives;Nanosilicon dioxide;ICP-OES;ALT;AST

2016-12-29

刘嘉祺(1994-)，女，本科，主要从事肺纤维化研究，E-mail:13315559650@163.com。

*通讯作者:郝小惠(1971-)，女，硕士，教授，主要从事肺纤维化研究，E-mail:haoxiaohui2005@163.com。

河北省科学技术研究与发展计划项目(10276116D)；唐山市老年医学科技创新团队(15130212C)。

TS202.3

A

1002-0306(2017)13-0292-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.054