中－低剂量阿托伐他汀对急性心肌缺血性损伤中内皮祖细胞功能的影响

王亮，钟武，陈睦虎

中－低剂量阿托伐他汀对急性心肌缺血性损伤中内皮祖细胞功能的影响

王亮，钟武，陈睦虎

目的：通过研究内皮祖细胞（EPC）增殖、迁移、分化及细胞因子的分泌，探讨中－低剂量的阿托伐他汀对急性心肌缺血性损伤患者的外周血EPC的影响。

方法：选择急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者80例，根据服用阿托伐他汀的剂量不同，随机分为观察组（阿托伐他汀40 mg）和对照组（阿托伐他汀20 mg），每组各40例。采用四唑盐（MTT）比色法、流式细胞术和酶联免疫吸附测定的方法，检测药物治疗前后不同时间点STEMI患者体内循环的EPC细胞数量、增殖能力和细胞因子的分泌。

结果：观察组和对照组阿托伐他汀治疗2周内均使EPC明显增殖，迁移能力有较大改变。治疗期间细胞因子的分泌表现为内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、趋化因子4（CXCR4）出现先增加后减少，但沉默调节蛋白1（SIRT1）持续增加。各组数据显示观察组和对照组差异无统计学意义。

结论：STEMI患者服用中－低剂量的阿托伐他汀能有效改善EPC的增殖和迁移能力，增加了CXCR4、VEGF、bFGF及SIRT1的表达。

心肌缺血；内皮祖细胞；降血脂药

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:697.)

急性冠状动脉（冠脉）供血不足导致心脏供氧量减少，从而发生心肌缺血性损伤。在此过程中，不同程度缺血的心肌细胞与正常的心肌细胞之间生化功能和电功能等均发生改变。从而出现心电活动的延迟、紊乱等[1]。正常情况下，机体可通过自身调节，保持心脏正常工作，但是由疾病产生的急性心肌缺血性损伤将导致长期的冠脉供血不足，致使心肌细胞发生不可逆转的损伤[2]。目前，心肌缺血的患病率呈逐年上升且年轻化趋势，有效地预防和治疗早期心肌缺血显得尤为重要。内皮祖细胞（EPC）是一类在血液中循环并能分化为血管内皮细胞的前体细胞。EPC主要参与血管内皮细胞修复和血管新生，维持血管内皮的完整性，生成新的血管。近年来，EPC的研究成为医学研究领域的新热点，为缺血性心脏病的治疗提供了新思路[3]。大量研究表明，他汀类药物能降低血管氧化应激，改善和恢复内皮功能，调节免疫活性，稳定斑块，促进缺血组织的新血管生成[4]。本研究观察阿托伐他汀对急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者EPC 增殖、迁移和细胞因子分泌等的影响，进一步明确他汀类药物的作用机制，为急性心肌缺血性损伤的防治提供有效治疗策略。

1 材料与方法

研究对象：选择2015-02至2015-08期间我院心血管内科收治的STEMI患者80例，依据《2012年欧洲心脏病学会STEMI管理指南》的诊断标准确诊，根据所服用阿托伐他汀（商品名：立普妥，美国辉瑞制药有限公司生产）的剂量不同，分为观察组（阿托伐他汀40 mg，n=40）和对照组（阿托伐他汀20 mg，n=40）。两组患者在冠脉血管病变程度、置入支架数、血管病变长度及管腔狭窄程度等方面无差异。所有患者接受经皮冠脉介入治疗（PCI），每日按照剂量要求口服阿托伐他汀。入选患者均为初始接受他汀类药物治疗，排除不明原因的丙氨酸氨基转移酶（ALT）持续性升高或活动性肝病患者以及用药过程中肌酸激酶（CK）严重升高的患者等。

阿托伐他汀对外周血EPC数目的影响：每例患者在治疗前、治疗后第15、30、60、90、120天6个时间点取外周血20 ml，ficoil 梯度离心。将其铺在包被有人纤连蛋白（h-FBN，5μg/cm2）的24孔板上，用Lonza EGM-2内皮细胞生长培养基培养，培养4天后细胞换液，除去悬浮的细胞。第7天收集贴壁细胞。用DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白（DilacLDL，终浓度2.4 mg/L）37℃孵育1 h，4%多聚甲醛固定10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。再用异硫氰荧光素（FITC）标记的荆豆凝集素IFITC-UEA-I（终浓度10 mg/L）37℃孵育1 h。PBS（PH=7.4）清洗一遍后在荧光显微镜下观察并计算10个视野（×200）EPC 双染阳性细胞。

阿托伐他汀对外周血EPC生物学功能的影响：（1）MTT检测EPC细胞增殖能力：取第7天的贴壁细胞计数，将5×103个细胞接种到包被纤连蛋白的96孔培养板，过夜，每孔加10μl MTT（5 mg/ml），培养4 h后，吸掉上清液，加入二甲基亚砜（150μl/ well），酶标仪上490 nm 波长读数。（2）Transwell迁移实验检测EPC的迁移能力：在下室底部涂上一层纤连蛋白，晾干后，将25μl Lonza EGM-2 培养基添加到内皮细胞生长因子VEGF-165，终浓度为50 ng/μl加入下室。再将2×104个 EPC 悬浮在50μl 培养基中，注入上室。37℃培养24 h后，去掉上室，甲醇固定，Giemsa 染色，随机选择3个显微镜视野下，观察EPC的数目。

酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测EPC 细胞因子分泌：通过检测不同剂量的阿托伐他汀对EPC细胞因子趋化因子受体4（CXCR4）、血管内皮生长因子（VEGF）、重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、沉默调节蛋白1（SIRT1）分泌的影响，判断EPC的增殖、内皮修复等情况。时间点设定为服药前及服药后第15、30、60、90、120天。VEGF可直接刺激血管内皮细胞移动、增殖及分裂，增加微血管通透性，在体内诱导血管新生。CXCR4是基质细胞衍生因子-1（SDF-1）的受体，高度保守。SDF-1介导趋化反应，其表达量由CXCR4的表达水平决定。CXCR4表达量越高，SDF-1诱导发生EPC 发生的迁移细胞越多。bFGF是碱性成纤维细胞生长因子的异构体，参与内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。SIRT1与细胞增殖、分化、衰老、凋亡和代谢密切相关，可抵抗内皮细胞的衰老。取专用酶标版，包被一抗后4℃冰箱孵育过夜。洗板后依次加入标准品和样本。37℃孵育1 h。洗板，每孔加入酶标记的二抗，37℃孵育1 h。洗板，加入底物，与酶反应后显色30 min，最后加入柠檬酸中止反应。450 nm波长读数，测吸光值（OD），描绘标准曲线，计算样本含量。

统计学方法：采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理。计量资料以 ±s 表示。两组均数间比较采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1EPC 鉴定结果（图1）

人纤连蛋白对EPC有特殊的亲和力，增加EPC细胞的贴壁。培养7天收集的细胞用Dil-acLDL和FITC-UEA-I双染，通过倒置荧光显微镜观察到，细胞同时被染成红色（DiI-AcLDL染色）和绿色（FITC-UEA-I染色），此类细胞为早期分化的EPC。倒置荧光显微镜下随机取15个视野，仪器自动分析统计双染阳性的细胞，再进行台盼蓝染色，计算总细胞数目，计算双染阳性细胞占总细胞的比例。结果为约90%的贴壁细胞为EPC。

2.2阿托伐他汀对EPC生物学功能的影响（表2）

MTT 方法检测EPC的增殖和迁移实验结果显示，观察组与对照组患者术后应用阿托伐他汀治疗2周和4周EPC增殖能力均较治疗前增强（P<0.01），但两组比较差异无统计学意义。

图1 内皮祖细胞染色鉴定

2.3细胞因子分泌结果（图2）

CXCR4的分泌浓度在治疗30天时达高峰，然后逐渐减少。说明与观察组比较，对照组细胞迁移及归巢能力更好。SIRT1不断增加，且对照组略高于观察组。VEGF、bFGF分泌量先增加，后减少，在治疗60天时浓度曲线达到高峰。考虑这与早期血管内膜急性损伤、调动激活外周循环EPC有关。

表2 两组EPC增殖和迁移的结果比较（±s）

图2 观察组（40 mg） 和对照组（20 mg） 趋化因子受体4、血管内皮生长因子、重组碱性成纤维细胞生长因子、沉默调节蛋白1的分泌

3 讨论

冠脉介入治疗已成为当前治疗急性心肌梗死最行之有效的方法之一，但是术后选择合适的药物及相应的剂量是防止病变血管发生再狭窄的关键。他汀类药物在降低血脂、恢复血管内皮功能、降低氧化应激、降低血管炎症、降低血栓形成和调节免疫活性、稳定粥样斑块等方面有良好的表现。他汀类是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的抑制剂，能使胆固醇的合成减少，清除增加，显著降低血清总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的浓度，被广泛应用于临床和科学研究。众多研究发现，他汀类药物在治疗过程中能促进EPC的增殖和分化[5-7]。EPC即内皮细胞分化的前身，起源于骨髓，在血液中循环，参与受损的内皮细胞与组织的修复，促进动物缺血组织的新生血管生成[8]。在心肌急性缺血时，EPC能招募骨髓和血液循环系统中的EPC进入缺血区，对损伤的血管内膜进行修复。在修复的过程中，分泌一些细胞因子，诱导新血管的再生，加速血管的内皮化。有研究表明，血液中循环的EPC的数量减少，可用于预测未来的心血管事件[9]。内皮祖细胞在分化过程中可分为早期或晚期EPC。据文献报道，体外培养原代EPC，4~7 天内出现早期分化的EPC，在21 天后则逐渐发展为晚期分化的EPC[10,11]。早期分化的EPC可能表现在为周围组织提供营养支持，而晚期EPC则多分化为成熟的内皮细胞，促进血管的修复[12,13]。研究急性心肌梗死患者术后长期服用不同剂量的他汀类药物体内EPC的增殖及对血管的修复能力的影响，是研究有效延缓血管衰老、增强血管的自修复能力重要途径。本研究结果显示，观察组和对照组阿托伐他汀治疗2周较治疗前EPC数量明显增加。同时，CXCR4、bFGF、VEGF分泌量随不同时间点也表现出先增加后减少的趋势。表明患者在治疗过程中，药物对EPC先起效较为明显，但是随着治疗时间的延长，EPC表现出适应性，且受机体的干预逐渐明显。在治疗过程中， SIRT1一直保持增长的趋势，表现出药物有抵抗EPC衰老的功能。观察组与对照组的样本量不够大以及检测的细胞因子种类有限，不能更为全面地分析不同剂量的他汀类药物对EPC生长和分化的影响。

综上所述，中－低剂量的阿托伐他汀对急性心肌梗死患者体内EPC增殖分化和细胞因子的分泌都有积极的影响，为防止术后血管再狭窄有着重要的意义。

[1] Sobieraj DM, White CM, Kluger J, et al. Systematic review: comparative effectiveness of adjunctive devices in patients with ST-segment elevation myocardial infarction undergoing percutaneous coronary intervention of native vessels. BMC Cardiovasc Disord, 2011, 11: 1471-2261.

[2] Mamas MA, Fraser D, Fath-Ordoubadic F. The role of thrombectomy and distal protection devices during percutaneous coronary interventions. EuroIntervention, 2008, 4: 115-123.

[3] Hill JM, Zalos G, Halcox JP, et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med, 2003, 3: 593-600.

[4] Kanda M, Satoh K, Ichihara K. Effects of atorvastatin and pravastatin on glucose tolerance in diabetic rats mildly induced by streptozotocin. Biol Pharm Bull. 2003, 26: 1681-1684.

[5] Ciszewski M, Pregowski J, Teresinska A, et al. Aspiration coronary thrombectomy for acute myocardial infarction improves myocardial salvage index: single center randomized study. Circulation, 2008, 118: S764.

[6] 罗江宾, 王天松, 方明. 斑块成份对经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄的影响. 中国循环杂志, 2013, 28: 176-178.

[7] Antoniucci D, Valenti R, Migliorini A, et al. Comparison of rheolytic thrombectomy before direct infarct artery stenting versus direct stenting alone in patients undergoing percutaneous coronary intervention for acute myocardial infarction. Am J Cardiol, 2004, 93: 1033-1052.

[8] Paradisi G, Bracaglia M, Basile F, et al. Effect of pravastatin on endothelial function and endothelial progenitor cells in healthy postmenopausal women. Clin Exp Obstet Gynecol, 2012, 3: 153-159.

[9] Schmidt-Lucke C, Fichtlscherer S, Aicher A, et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One, 2010, 5: e13790.

[10] Sata M, Nishimatsu H, Osuga JI, et al. Statins augment collateral growth in response to ischemia but they do not promote cancer and atherosclerosis. Hypertension, 2004, 4: 1214-1220.

[11] Steinmetz M, Pelster B, Lucanus E, et al. Atorvastatin-induced increase in progenitor cell levels is rather caused by enhanced receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) cell proliferation than by bone marrow mobilization. J Mol Cell Cardiol, 2013, 6: 32-42.

[12] Antonio N, Fernandes R, Soares A, et al. Reduced levels of circulating endothelial progenitor cells in acute myocardial infarction patients with diabetes or pre-diabetes: accompanying the glycemic continuum. Cardiovasc Diabetol, 2014, 10: 1475-2840.

[13] 赵蓓, 刘利峰, 刘瑛琪, 等. 阿托伐他汀对稳定性心绞痛患者血浆微小核糖核酸-143/145表达水平的影响. 中国循环杂志, 2014, 29: 1039-1043.

Impact of Middle and Low Dose Atorvastatin on Endothelial Progenitor Cell Function in Patients With Acute Myocardial Ischemia Injury

WANG Liang, ZHONG Wu, CHEN Mu-hu.
Department of Emergency, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou (646000), Gansu, China
Correspondence Author: WANG Liang, Email: ajhl64@163.com

Objective: To explore the impact of middle and low dose atorvastatin on peripheral endothelial progenitor cells (EPCs) in patients with acute myocardial ischemia injury via investigating EPC proliferation, migration, differentiation and secretion of cytokines.

Method: A total of 80 patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI) were randomly divided into 2 groups: Observation group, the patients received atorvastatin 40 mg and Control group, the patients received atorvastatin 20 mg. n=40 in each group. The number of circulating EPC, EPC proliferation ability and the secretion of cytokines before and at different time points after drug therapy were examined by means of MTT, flow cytometry and ELISA.

Results: The number of EPC was obviously increased with greatly changed migration ability within 2 weeks atorvastatin treatment in both groups. The secretion of cytokines presented that the contents of VEGF, bFGF, CXCR were elevating first followed by reducing thereafter, while the content of SIRT1was continuously increasing during the period of treating. The above parameters were similar between 2 groups.

Conclusion: Middle and low dose atorvastatin could effectively improve EPC proliferation and migration, increase the expressions of CXCR4, VEGF, bFGF and SIRT1 in STEMI patients.

Myocardial ischemia; Endothelial progenitor cells; Lipid-lowering drug

2016-09-19）

（编辑：许菁）

646000四川省泸州市，西南医科大学附属医院 急诊科

王亮 主治医师 学士 研究方向为急诊创伤、急诊介入 Email:ajhl64@163.com 通讯作者：王亮

R54

A

1000-3614（2017）07-0697-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.07.018