慢性制动应激建立卵巢早衰及卵巢低反应小鼠模型的研究

2017-07-27申可佳申奏秦旋刘碧源付灵梅

中国医药导报 2017年17期

申可佳++申奏秦旋++刘碧源++付灵梅+++熊桀

[摘要] 目的探讨慢性制动应激建立卵巢早衰及卵巢低反应小鼠模型的方法。方法利用自制制动器对SPF级ICR雌性小鼠进行制动，造成慢性应激状态，观察小鼠的一般情况，称量体重，阴道涂片观察动情周期。制动完全结束后进行微刺激超排卵，在超排卵第3天和HCG注射后24 h计数各级卵泡。结果与未制动小鼠相比，制动期间小鼠的进食、毛色等一般情况变差，体重明显减轻（P < 0.05），动情周期异常的例数明显增多（P < 0.05），但超排卵第3天和HCG后24 h小鼠各级卵泡计数比较，制动小鼠与未制动小鼠没有明显区别（P > 0.05）。结论慢性制动应激可以引起小鼠卵巢功能紊乱或减退，但能否造成卵巢早衰及卵巢低反应还需进一步探讨。

[关键词] 卵巢早衰；卵巢低反应；慢性应激；小鼠

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（b）-0019-04

Study on establishment of premature ovarian function and poor ovarian response mice model through chronic stress

SHEN Kejia SHEN Zouqinxuan LIU Biyuan FU Lingmei XIONG Jie

TCM University of Hu'nan， Hu'nan Province， Changsha 410208， China

[Abstract] Objective To explore the method of chronic immobilization stress which can establish the mice model of premature ovarian function （POF） and poor ovarian response （POR）. Methods Self-made brakes were used to make chronic stress stateon SPFICR female mice， during the general situation， body weight and estrous cycle of these mice were observed. The microstimulated super ovulation was used on the mice after immobilization， and the follicles of the mice were counted respectively on the third day of superovulation and 24 h after HCG injection. Results Compared with those in the non-immobilization mice， the general situation such as eating， hair color and so on were worse， the body weight significantly reduced （P < 0.05）， and the number of abnormal estrous cycle distinct increased （P < 0.05） in the immobilization mice during the braking period. But there was no obvious difference of the follicle number between the immobilization mice and the non-immobilization mice at various levels on the third day of superovulation and 24 h after HCG injection （P > 0.05）. Conclusion Chronic immobilization stress can causethe disorder or degradation of ovarian function，and further study is needed to find whetherit can cause premature ovarian function and poor ovarian response.

[Key words] Premature ovarian function； Poor ovarian response； Chronic stress； Mice

輔助生殖超排卵过程中卵巢对促性腺激素的刺激反应低下称为卵巢低反应（POR），病因与年龄、遗传和免疫、手术和感染、环境等因素相关，还有一类无明确病因可循，可能是因长期压力应激导致卵巢功能衰退（特发性POF）而引起的POR在临床也越发多见[1-4]。目前基础研究大多为化疗药物、免疫及半乳糖等所致POF动物模型，少见特发性POF/POR动物模型[5-9]。本实验拟在模拟人类特发性POF的发病经过，用重复制动造成小鼠慢性应激状态，并在制动结束后进行超排卵，探讨是否能建立POF/POR小鼠模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

6周龄健康SPF级ICR雌性小鼠80只和成年雄性小鼠20只，体重为22～25 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK（湘）2011-0003。实验遵循湖南省实验动物保护和使用指南，并经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 超排卵药物

来曲唑片（LE）：江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号H19991001。注射用尿促性腺激素（Gn）：丽珠集团丽珠制药厂生产，批号H10940097；注射用绒毛膜促性腺激素（HCG）：丽珠集团丽珠制药厂生产，批号H44020673。

1.1.3 仪器

自制制动器：用50 mL塑料注射器改造而成，管壁上每隔5 mm左右用烧红的探针戳穿，形成直径约2 mm的小孔。TP-5000動物称重器：湘仪天平仪器厂；光学显微镜：日本Olympus。

1.1.4 试剂

二甲苯，100%、95%、80%、70%乙醇，苏木素，1%的盐酸乙醇，1%的稀氨水，伊红，中性树胶，瑞氏染液。

1.2 方法

1.2.1 分组及制动

6周龄ICR雌性小鼠80只，正常喂养1周后随机分为四组，分别为模型组、西药组、中药组、正常对照组。称量并记录体重。模型组、西药组、中药组小鼠每上午放入制动器内制动，共制动14 d；每天制动时间从3 h开始，每天延长0.5 h，至最长制动时间为每天6 h，造成小鼠应激状态；正常对照组不制动。制动第10天开始至制动第14天结束，每天阴道涂片并用瑞氏染色观察小鼠动情周期。正常的小鼠动情周期为4～5 d，有四期规律的变化，分别为动情前期（17～21 h）、动情期（9～15 h）、动情后期（10～14 h）和动情间期（60～70 h）。若发现动情周期紊乱无规律交替，或在某期明显延长或持续停留在间期记为动情周期异常，提示小鼠卵巢功能紊乱和/或减退[10-11]。第14天制动结束后再次称量所有小鼠体重。

1.2.2 给药

1.2.2.1 各组小鼠均在第15天启动微刺激超排卵，具体方案为LE+Gn+HCG，即先用LE 0.013 mg/d每日灌胃1次，共5 d；接下来用Gn 0.39 U/d每日腹腔注射1次共7 d，使用Gn最后1天傍晚雌雄鼠合笼，次日晨检查阴栓，有阴栓者腹腔注射1次HCG（25.71 U/次）。

1.2.2.2 西药组和中药组在制动期间分别使用干预卵巢低反应的西药和中药（西药组：第8～19天，每天1次生长激素0.01 U/d腹腔注射，第15天开始至处死日每天1次阿司匹林0.2 mg/d灌胃；中药组第1天开始至处死日每天1次护卵汤0.597 g/d灌胃，护卵汤组配方参考文献[12]。模型组和正常对照组未使用干预治疗药物。

1.2.2.3 各组小鼠每天在相同时间段进行相应的药物灌胃及腹腔注射，不使用药物的小鼠用生理盐水代替药物，保证组间灌胃及腹腔注射操作一致。

1.2.3 标本采集

每组小鼠在超排卵启动第3天上午脱颈椎处死10只，开腹取出卵巢。每组余下雌鼠在注射HCG前1 d晚上与雄鼠以2∶1比例合笼过夜，次日早晨7：00检查雌鼠，将有阴栓的雌鼠注射HCG，24 h后脱颈椎处死，开腹取出卵巢。没有阴栓的雌鼠继续与雄鼠以2∶1比例合笼过夜，直至发现阴栓后，再按上述方法处理获取卵巢。

1.2.4 卵泡计数

每组随机8只小鼠的一侧卵巢组织（左右随机）用10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片后HE染色，高倍镜下观察。每组随机选择8张切片（不含连续切片），每张切片选取3个不同区域计数，将每组各张切片3个区域计数的各级卵泡数累积为每组原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡的总个数。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

正常对照组从实验开始到实验结束外观及活动状态均无异常，体重适度增加。其他组小鼠造模开始后逐渐出现进食减少，二便减少，行动迟缓，四肢无力，毛色晦暗无光并出现不同程度的脱落，制动结束后明显较正常对照组瘦弱；制动结束后到实验结束这段时间这些小鼠逐渐恢复进食及二便，行动变活泼，毛色恢复光泽，体重增加。

2.2 各组小鼠体重变化

在各组小鼠开始制动前、完全结束制动后、HCG 24 h后3个时间点称量各组小鼠的体重。组间比较结果显示：完全结束制动后模型组、西药组、中药组小鼠体重均低于正常对照组小鼠，差异有统计学意义（P < 0.05），提示制动应激对小鼠体重造成不良影响；HCG 24 h后西药组和中药组小鼠体重低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。组内比较结果显示：各组小鼠随时间推移在制动前、完全结束制动后、HCG 24 h后3个时间点体重逐步增加，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.3各组小鼠动情周期变化

至制动结束，模型组、西药组、中药组发生动情周期异常的小鼠明显多于正常组，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05），提示制动实验使小鼠处于应激状态对卵巢功能有不良影响。见表2。

2.4 各组小鼠卵巢组织内各级卵泡数量及比例

分别在超排卵第3天和HCG 24 h后获取小鼠卵巢组织，结果显示：四组小鼠卵巢组织内各级卵泡所占比例差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3～4。

3 讨论

现代社会女性身兼家庭工作多重角色，承受的压力越来越大，长期焦虑、忧郁、愤怒等负面情绪作为应激，不断刺激下丘脑-垂体-卵巢轴，引起神经内分泌及卵巢功能紊乱，卵巢功能的受损引起女性生殖功能退化，出现月经失调、闭经、不孕等等系列疾病，严重影响女性的生活质量并加速机体衰老进程。即使在辅助生殖技术如此发达的今天，仍有部分患者因卵巢功能衰退无法获得足够的高质量卵子而失去生育的机会，给患者身心及社会经济带来巨大的压力。对于卵巢功能障碍，西医多用激素替代治疗及诱导排卵等方法，但疗效不确切，副作用大且费用昂贵，中医药的优势越来越受关注[12-20]。所以本研究中，希望通过应激模拟人类特发性POF发病经过，建立相关的动物模型，用以探讨西医和中医在此方面的疗效。

制动（束缚）是最常用的身心应激模型，本实验将50 mL注射器改造成制动器，与实验小鼠的体型大小匹配，用烧红的探针将针筒的前壁及侧壁布满小孔，以减少塑料管内温度升高，小鼠放入制动器后堵住活塞使其活动受限，但可进食。实验采用重复制动的方法，每天制动时间从3 h开始，以后每天延长0.5 h，至最长制动时间为每天6 h，使小鼠处于慢性应激状态。实验结果显示，与未制动小鼠相比，经过14 d慢性重复制动处理的小鼠，无论是单纯制动的模型组，还是使用西药或中药干预的制动西药组、中药组，在制动期间进食、活动、精神、毛色等一般情况明显变差，体重明显减轻（P < 0.05），動情周期紊乱及延长/停滞的例数明显增多（P < 0.05）。重复制动作为慢性应激，刺激下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴异常活化，使糖皮质激素持续升高导致海马神经元受损；同时在应激中发挥调节作用的去甲肾上腺素不断耗竭，导致抑郁样症状的发生[21]。故本研究观察到慢性应激后小鼠活动和进食明显减少、体重减轻、反应迟钝、皮毛枯燥，与各种抑郁症状相一致。高水平的糖皮质激素会直接抑制性腺轴，导致促性腺激素释放激素及促性腺激素分泌减少，同时卵巢对促性腺激素的反应降低，最终影响卵巢的分泌功能[22-23]。卵巢分泌的雌激素减少导致血清中雌激素水平降低，雌激素的应激性降低与动情周期的应激性变化高度相关。有报道慢性应激导致动物血浆雌激素不同程度降低，部分动物周期未受影响或性周期延长但仍有规律，部分动物血浆雌二醇在动情前期的生理峰值进一步降低或消失，阴道涂片结果表现为无规律或持续处于间期，与更年期大鼠一致[11]。本实验结果发现慢性制动应激能导致大部分小鼠动情周期异常，可建立卵巢功能紊乱或减退模型，与文献报道一致[24]。

制动完全结束后对各组小鼠进行微刺激超排卵，于超排卵第3天和HCG 24 h对小鼠卵巢内原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡进行计数，结果显示制动小鼠与未制动小鼠之间各级卵泡数差异无统计学意义（P > 0.05），各制动组小鼠之间也没有明显区别（P > 0.05）。小鼠各级卵泡中，原始卵泡数代表卵巢的储备功能，与POF直接相关，窦卵泡数代表能发育为成熟卵泡的数量，与POF和POR直接相关。本实验中各组小鼠间各级卵泡数目没有显著差别，说明未建立POF/POR小鼠模型。是否需要延长应激天数或改变应激方式才能建立POF/POR动物模型，据研究报道[11，25]，制动前期小鼠对应激的反应最明显，一般不超过25 d，随着应激天数的增加，制动14 d后小鼠逐渐对应激产生适应，动情周期恢复正常，故本实验选择实施制动14 d而没有继续更长时间。还有研究报道[11，22]通过束缚、冷热刺激、被动吸烟等多种慢性应激的方法或重复制动可导致大鼠卵巢功能紊乱，但只有部分大鼠出现POF，这些结果均与本实验结果方向一致，提示应激方法不能得到稳定的POF动物模型，但是能得到稳定的卵巢功能紊乱动物模型。经本实验验证，这种动物模型在超排卵刺激后没有发生卵巢低反应，故今后若研究卵巢低反应相关疾病，选择化疗药物或免疫因素造成POF或许更能成功建立POR动物模型。

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