三七总皂苷在兔牙齿移动过程中对牙周组织转化生长因子-β1表达的影响*

杨 璐，王 冠，黎 婷#，孙晋虎

1)徐州医科大学口腔医学院 江苏徐州 221004 2)徐州医科大学附属第二医院口腔科 江苏徐州 221006 3)徐州医科大学附属医院口腔科 江苏徐州 221004

三七总皂苷在兔牙齿移动过程中对牙周组织转化生长因子-β1表达的影响*

杨 璐1,2)，王 冠1,2)，黎 婷1,2)#，孙晋虎1,3)

1)徐州医科大学口腔医学院 江苏徐州 221004 2)徐州医科大学附属第二医院口腔科 江苏徐州 221006 3)徐州医科大学附属医院口腔科 江苏徐州 221004

#通信作者，女，1974年12月生，硕士，副主任医师，研究方向：错牙合畸形的矫治及机制研究，E-mail:2492767182@qq．com

三七总皂苷；兔；牙齿移动；牙周组织；转化生长因子-β1

目的：观察在牙齿移动过程中三七总皂苷(PNS)对兔牙周组织转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法：选用3～6月龄的雄性新西兰兔16只，随机分成PNS组和生理盐水(NS)组，通过拉簧分别加力于下颌双侧第一前臼齿与门牙之间，建立兔牙齿移动模型，然后两组分别肌内注射血栓通[10 mg/(kg·d)]和NS。建模前1周，建模后1、2、3、4周后分别采血，全自动生化分析仪检测血清中钙离子、磷离子以及碱性磷酸酶的含量。建模后第4周处死兔，取移动牙齿及其牙周组织，采用免疫组化染色和免疫荧光染色方法检测TGF-β1的表达。结果：PNS组血清中碱性磷酸酶的含量高于NS组(P<0.05)，牙周组织中TGF-β1的表达高于NS组(P<0.05)。结论：在牙齿移动过程中，PNS能增加兔牙周组织中TGF-β1的表达，对牙槽骨的改建有一定的促进作用。

三七总皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是三七的主要化学成分，具有扩血管、抑制血小板凝聚、抗炎、抗氧化等药理作用，临床上广泛应用于心脑血管和中枢神经系统疾病的治疗[1]。近些年随着对PNS的深入研究，学者们[2-6]发现其可以调节多种成体干细胞的分化，促进实验动物骨髓基质干细胞向成骨细胞的增殖和分化。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)广泛存在于正常组织细胞和转化细胞中，可在骨形成和重建中诱导间充质细胞转化，调节成骨细胞和破骨细胞的分化，促进细胞外基质的合成与分泌，从而协调间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞的活动，调节骨组织修复重建，是骨吸收和骨形成过程的重要调节因子[7-9]。作者通过建立兔牙齿移动模型，观察注射血栓通[3](纯度约97%的PNS)对兔移动牙齿的牙周组织TGF-β1蛋白表达的影响，探讨PNS对移动牙齿的牙周组织改建的作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 3～6月龄新西兰兔由徐州医科大学实验动物中心提供(合格证编号：NO.201603253)。镍钛拉簧(北京圣玛特科技有限公司)，牙用结扎丝0.20 mm，正畸测力计，牙科粘结剂，注射用血栓通(冻干)(250 mg/支，广西梧州制药集团股份有限公司)，TGF-β1抗体(北京博奥生物技术有限公司)，免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，驴抗兔二抗(SC-2095)(Stanta公司)，显微镜成像系统、正置显微镜(Olympus公司)，石蜡包埋机(Shadon Hispocentre公司)，RM2235型石蜡切片机(Leica公司)，Cobas 8000全自动生化分析仪(Roche公司)，Centrifuge 5702低速离心机(Eppendorf公司)

1.2 新西兰兔实验性牙齿移动模型的建立及分组处理 选用16只雄性新西兰兔，均独立笼养，自由进食，观察1周后用于实验。采用随机数字表法分为PNS组和生理盐水(NS)组2组，每组8只。PNS组按10 mg/(kg·d)肌内注射血栓通，NS组注射相应剂量生理盐水，自正畸后第1天开始每d肌内注射用药，直至处死前1 d。按30 mg/kg耳缘静脉注射戊巴比妥钠进行全身麻醉后，将动物固定在兔台上，拉开口角，显露牙齿。凝胶酸蚀剂酸蚀牙齿显露的轴面，用注射器冲洗，及时吸取冲洗液，谨防水误入气道导致兔死亡。隔湿，干燥，将镍钛拉簧分别固定于下颌左右第一前臼齿和门牙之间，并将两个门牙结扎在一起，以下颌前牙为支抗拉下颌双侧第一前磨牙向近中移动(图1)。将力控制在80 g，用牙用粘结剂固定结扎在牙齿上的结扎丝，去除多余粘结剂，待其室温干燥粘固后，建模结束，实验加力4周。术后注意动物保温，待动物苏醒后送回独立笼内。密切观察兔术后精神状态、饮食量及体重的变化。正畸牙移动4周结束。

图1 新西兰兔实验性牙齿移动模型的建立

1.3 血液标本采集及检测 分别于建模前1周，建模后1、2、3、4周沿耳缘静脉采集兔血，每只3～5 mL，装入一次性真空采血管，注意避免溶血，室温放置2 h使血清分离后，3 000 r/min离心5 min，吸取上层血清，分装，-80 ℃冻存备用。利用全自动生化分析仪分别测定血清中钙离子、磷离子、碱性磷酸酶的含量。

1.4 牙周组织标本制备 牙移动4周结束时用空气栓塞法处死动物，将兔牙齿移动区骨组织连同移动的第一前臼齿一同取下，生理盐水冲洗去除血液后，立即放于40 g/L多聚甲醛中固定一周。修正组织块，经体积分数10% EDTA(pH=7.4)脱钙5～6周，每隔1周更换脱钙液。当针可以无阻力穿透骨组织时，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm近远中方向切片备用。

1.5 牙周组织中TGF-β1蛋白表达的免疫组化检测 取石蜡切片，脱蜡，复水，柠檬酸缓冲液微波加热进行抗原修复，自然冷却至室温，按免疫组化试剂盒说明书进行，完成免疫染色步骤，显微镜观察并拍照记录。利用图像分析软件Image-pro plus 6.0 计算牙周组织切片中阳性染色区域的平均光密度。

1.6 牙周组织中TGF-β1蛋白表达的免疫荧光检测 取石蜡切片，水化，抗原修复，BSA+Triton封闭液封闭，37 ℃ 1 h，分别滴加一抗、荧光二抗，湿盒避光4 ℃孵育过夜。DAPI复染，甘油封片，荧光正置显微镜观察拍照。利用图像分析软件Image-pro plus 6.0 计算牙周组织切片中阳性染色区域的平均光密度。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0进行分析。应用重复测量数据的方差分析比较2组动物不同时间点血清中碱性磷酸酶、磷和钙含量的差异，应用t检验和秩和检验分析2组动物牙周组织中TGF-β1蛋白表达的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组动物血清中碱性磷酸酶、磷和钙含量的比较 见表1、2、3。

2.2 2组动物牙周组织中TGF-β1蛋白表达的比较 免疫组化检测结果见图1。TGF-β1在PNS组牙周组织中近牙周膜的牙槽骨区(即新骨形成区)阳性表达，在张力侧的表达较压力侧强且分布范围更广。PNS组TGF-β1平均光密度值为(0.178±0.011),NS组TGF-β1为(0.151±0.002)，2组比较差异有统计学意义(t=2.220,P=0.038)。

表1 2组动物建模前、后血清中碱性磷酸酶含量比较 U/L

F组间=4.802，P=0.046；F时间=49.991，P<0.001；F交互=1.132，P=0.339。

表2 2组动物建模前、后血清中磷浓度比较 mmol/L

F组间=1.241，P=0.284；F时间=1.600，P=0.187；F交互=1.697，P=0.164。

表3 2组动物建模前、后血清中钙浓度比较 mmol/L

F组间=2.961，P=0.107；F时间=11.190，P<0.001；F交互=1.141，P=0.347。

免疫荧光检测结果见图2。免疫荧光染色以牙周组织出现红色荧光为阳性表达。TGF-β1在PNS组牙周组织中呈阳性表达，张力侧的新骨形成区表达较压力侧明显。TGF-β1在NS组牙周组织中几

上：PNS组；下：NS组；AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；D：牙齿；T：张力侧；P：压力侧。图1 2组动物近远中牙周组织中TGF-β1蛋白表达的免疫组化检测结果(PV,×100)

乎不表达，只在张力区有微弱表达。PNS组TGF-β1平均光密度值为66.333(62.928,67.047)，NS组为51.608(50.691,56.097)(Z=3.477,P=0.001)。

上：PNS组；下：NS组；AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；D：牙齿；T：张力侧；P：压力侧。图2 2组动物近远中牙周组织中TGF-β1蛋白表达的免疫荧光检测结果(×100)

3 讨论

牙齿移动的过程也是牙周组织改建的过程，期间牙周骨组织(牙槽骨)的改建不容忽视。研究[10-12]证实,前列腺素E(PGE)、白介素1(IL-1)、骨形成发生蛋白2(BMP-2)、TGF-β1等都对骨改建有一定的促进作用。TGF-β1作为骨形成和骨吸收的重要调节因子，能趋化成骨细胞活性，已有利用外源性TGF-β1 来促进骨折愈合及骨缺损修复的报道[13]。该实验结果表明：在牙齿移动过程中，PNS可促进牙周组织TGF-β1的表达。

碱性磷酸酶作为一组单酯酶，广泛存在于人体组织和体液中，其中大部分由骨细胞产生，小部分来自肝[14]。已有研究[15]表明，血清中碱性磷酸酶含量与骨代谢活动密切相关，在骨折愈合、骨肉瘤、骨纤维异常增殖症等骨代谢旺盛的条件下，血清碱性磷酸酶的水平较高，且碱性磷酸酶活性的增加也可以增强成骨细胞的活性。该实验结果显示：在牙齿移动过程中，PNS组血清碱性磷酸酶含量高于NS组，说明在PNS的作用下，移动牙齿的牙周组织中成骨细胞相对活跃，对牙周骨组织改建有一定的促进作用。建模后，2组血清碱性磷酸酶含量及血清钙浓度均低于建模前，可能与加力后压力侧破骨细胞活跃有关，具体原因仍需进一步研究。

另有研究[16]表明TGF-β1可以使细胞的碱性磷酸酶活性升高，从而调节细胞分化，与该研究碱性磷酸酶和TGF-β1的变化趋势基本一致。

由于正畸加力周期一般不短于3周，临床复诊周期以4周较为常用[17]，并根据已有实验[18]，作者在该实验中设定了4个加力时间。针对该实验药物用量，有研究[3-4,6]虽涉及细胞培养药物用量,但是作用于动物牙周骨组织的适宜浓度尚无报道，该实验结合临床血栓通的使用剂量，参考《医学机能实验学》中的“人和动物间按千克体重折算剂量表”，即1.5 kg兔与60 kg人换算系数为3.30，初步确定实验中PNS用量约为10 mg/(kg·d)。对于PNS促进牙槽骨改建的适宜浓度以及临床运用的方法，仍需进一步研究。

综上，该实验表明，PNS在牙齿移动中，可能通过促进TGF-β1信号通路增强碱性磷酸酶的活性，增强成骨细胞活性，从而促进成骨反应，对牙周组织的改建起了一定的积极作用。

[1]张剑峰,张丹参.三七总皂苷药理作用研究进展[J].医学综述,2007,13(6):472

[2]刘锡文,李学东,傅华群,等.三七总皂甙对大鼠体内肝卵圆细胞增殖的调控及机制[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(33):6538

[3]LI XD,WANG JS,CHANG B,et al.Panax notoginseng saponins promotes proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells[J].J Ethnopharmacol,2011,134(2):268

[4]唐弈遥,周诺,郭宇航,等.三七总皂苷对兔BMSCs的成骨分化及TGF-β1表达的影响[J].口腔颌面外科杂志,2014,24(4):261

[5]WU B,MA X,ZHU D,et al.Lentiviral delivery of biglycan promotes proliferation and increases osteogenic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro[J].J Mol Histol,2013,44(4):423

[6]WANG Y,HUANG XP,TANG YY,et al.Effects of panax notoginseng saponins on the osteogenic differentiation of rabbit bone mesenchymal stem cells through TGF-β 1 signaling pathway[J].BMC Complement Altern Med,2016,16(1):319

[7]ERLEBACHER A,FILVAROFF EH,YE JQ,et al.Osteoblastic responses to TGF-beta during bone remodeling[J].Mol Biol Cell,1998,9(7):1903

[8]OZKAN K,ERALP L,KOCAOGLU M,et al.The effect of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) on the regenerate bone in distraction osteogenesis[J].Growth Factors,2007,25(2):101

[9]TANG Y,WU XG,LEI WQ,et al.TGF-beta1-induced migration of bone mesenchymal stem cells couples bone resorption with formation[J].Nat Med,2009,15(7):757

[10]齐鹏鹏,孟粼,吴梓萁,等.骨形成发生蛋白2在牙槽骨改建中作用的研究进展[J].吉林大学学报(医学版),2015,41(3):671

[11]张雁儒,张辉,马辉,等.BMP-2基因转染对兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和钙含量的影响[J].郑州大学学报(医学版),2014,49(1):102

[12]刘长庚,凌天牖,黄生高.加快正畸牙齿移动的外源性因素[J].临床口腔医学杂志,2007,23(9):564

[13]FERREIRA CL,MAUAD DE ABREU FA,BORGES SILVA GA,et al.TGF-β 1 and BMP-4 carried by liposomes enhance the healing process in alveolar bone[J].Arch Oral Biol,2013,58(6):646

[14]]BEDDHU S,MA X,BAIRD B,et al.Serum alkaline phosphatase and mortality in African Americans with chronic kidney disease[J].Clin J Am Soc Nephr,2009,4(11):1805

[15]JI Z,CHENG Y,YUAN P,et al.Panax notoginseng stimulates alkaline phosphatase activity, collagen synthesis, and mineralization in osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2015,51(9):950

[17]DI DOMENICO M,D'APUZZO F,FEOLA A,et al.Cytokines and VEGF induction in orthodontic movement in animal models[J].Journal of Biomedicine and Biotechnology,2012,2012:201689

[18]陈云.淫羊藿苷对大鼠正畸牙齿移动的影响[D].济南:山东大学,2015.

(2016-10-10收稿 责任编辑赵秋民)

Influence of panax notoginseng saponins on expression of TGF-β1 in periodontal tissue of rabbits during teeth movement

YANGLu1，2),WANGGuan1，2),LITing1，2),SUNJinhu1，3)

1)SchoolofStomatology，XuzhouMedicalUniversity，Xuzhou，Jiangsu221004 2)DepartmentofStomatology，theSecondAffiliatedHospital,XuzhouMedicalUniversity，Xuzhou，Jiangsu221006 3)DepartmentofStomatology，theAffiliatedHospital，XuzhouMedicalUniversity，Xuzhou，Jiangsu221004

panax notoginseng saponins；rabbit; movement of teeth；periodontal tissue；TGF-β1

Aim: To investigate the effect of panax notoginseng saponins(PNS) on the expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1) in periodontal tissue of rabbits during teeth movement. Methods: Sixteen 3-6-month-old male New Zealand rabbits were randomly allocated into two groups. The rabbits of PNS group were injected Xueshuantong and the rabbits of normal saline group were injected normal saline. Two tension springs with 80 g force were respectively applied between the first premolars and mandibular anterior teeth. After four weeks raising, the rabbits were sacrificed for the first premolars and periodontal tissues. Immunohistochemical staining and immunofluorescence staining were used to detect the expression of TGF-β1 in periodontal tissues of the teeth. At the day before modeling, and the 1st,2nd,3rd,and 4th week after modeling, blood samples were collected. The concentration of calciumion, phosphorus ion and alkaline phosphatase in serum was determined with automatic biochemical analyzer. Results: The concentration of alkaline phosphatase in serum in PNS group was higher than that in normal saline group(P<0.05). The expression of TGF-β1 of PNS group was stronger than normal saline group(P<0.05). Conclusion: Panax notoginseng saponins can promote the expression of TGF-β1 in the periodontal tissue of rabbits, and may play a certain role in promoting alveolar bone remodeling during teeth movement.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.019

*徐州市科技计划项目 KC14SH089

R783.5