盐酸米诺环素联合栀子苷对NO诱导PC12细胞凋亡的影响*

蔡智慧,王 晋,吴 琼,常全忠#

1)漯河医学高等专科学校基础部生理学教研室 河南漯河 462002 2)漯河医学高等专科学校基础部病理生理学教研室 河南漯河 462002

盐酸米诺环素联合栀子苷对NO诱导PC12细胞凋亡的影响*

蔡智慧1),王 晋1),吴 琼2),常全忠1)#

1)漯河医学高等专科学校基础部生理学教研室 河南漯河 462002 2)漯河医学高等专科学校基础部病理生理学教研室 河南漯河 462002

#通信作者，男，1965年12月生，博士，教授，研究方向：中枢神经系统的损伤及修复，E-mail：cqzchang@sina.com

盐酸米诺环素；栀子苷；PC12细胞；凋亡；Caspase-3；Bcl-2

目的：探讨盐酸米诺环素、栀子苷单独及联合应用对NO诱导PC12细胞凋亡的影响及其可能机制。方法：PC12细胞分为对照组、盐酸米诺环素组、栀子苷组和盐酸米诺环素+栀子苷组(联合应用组)。4组均用终浓度为0.5 mmol/L的NO供体SIN-1诱导细胞凋亡，SIN-1干预前12 h盐酸米诺环素组加入终浓度为0.1 mmol/L的盐酸米诺环素，栀子苷组加入终浓度为0.25 mmol/L的栀子苷，联合应用组加入同上浓度的盐酸米诺环素和栀子苷，对照组不给药。CCK-8法测定细胞存活率，Hoechest 33342荧光染色观察细胞凋亡情况，流式细胞仪测定细胞凋亡率，Western blot测定凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2的表达。结果：与对照组相比，单用盐酸米诺环素或栀子苷均能提高NO诱导的PC12细胞存活率，降低细胞凋亡率，增加Bcl-2蛋白表达，减少Caspase-3蛋白表达(P均<0.05)；二者联合应用对上述指标的影响具有协同效应(P<0.05)。结论：盐酸米诺环素和栀子苷均能抑制PC12细胞凋亡，且二者联合应用作用优于单独应用，其机制可能与抑制Caspase-3依赖性凋亡信号通路有关。

阿尔茨海默症(Alzheimer's disease，AD)是一种常见的神经系统退行性疾病，随着全世界人口老龄化的加重，其发病率逐年增加，成为一个严重的社会问题。目前，AD的发病机制尚不完全清楚。研究[1]报道，在AD等神经退行性疾病的病理生理过程中，神经元凋亡引起的神经元缺失起了主要作用。因此，选择和开发能有效拮抗神经元凋亡的靶点药物具有重要意义。资料[2-4]显示，盐酸米诺环素具有一定的神经保护作用，而中药栀子提取物栀子苷具有减轻脑水肿和减少炎性因子释放的作用。该研究利用3-吗啡斯德酮亚胺(3-morpholinosyndnomine，SIN-1)作为NO供体，诱导PC12细胞凋亡，观察盐酸米诺环素、栀子苷单独及联合应用对细胞凋亡及Caspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响，为盐酸米诺环素和栀子苷在AD等神经退行性疾病预防和治疗中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 栀子苷、SIN-1、CCK-8试剂均购自Sigma公司，盐酸米诺环素购自合肥博美生物科技有限责任公司，Bcl-2单克隆抗体、GAPDH抗体、Caspase-3多克隆抗体购自Abcam公司，Annexin V-FITC试剂盒购自罗氏公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司，BSA、Hoechest 33342、DMEM高糖培养基、IgG二抗、胰蛋白酶均购自Solarbio生物技术公司。

1.2 细胞培养与分组 低分化PC12细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。参考文献[5]用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养PC12细胞，置于体积分数5% CO2、37 ℃、饱和湿度下培养，细胞达80%融合时以2.5 g/L胰蛋白酶消化、传代，接种于96孔板，分为4组：对照组(SIN-1诱导凋亡)、盐酸米诺环素组(盐酸米诺环素+SIN-1)、栀子苷组(栀子苷+SIN-1)和联合应用组(盐酸米诺环素+栀子苷+SIN-1)。终浓度为0.5 mmol/L的SIN-1直接加入培养基中诱导细胞凋亡，盐酸米诺环素和栀子苷在SIN-1干预前12 h加入，终浓度分别为0.1 mmol/L和0.25 mmol/L，然后再共浴12 h。

1.3 CCK-8法测定细胞存活率 按照CCK-8试剂盒说明，参照文献[6]，取上述各组细胞，每孔加10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h，酶标仪450 nm波长下测定各孔OD值。细胞存活率(%)=(OD实验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)×100%。每组设10个复孔，实验重复3次。

1.4 Hoechest 33342染色观察细胞凋亡 参照文献[5]，取各组细胞，用0.01 mol/L PBS冲洗2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，空气干燥后Hoechest 33342(5 mg/L)避光染色15 min，PBS冲洗2次，倒置荧光显微镜下观察细胞核的形态。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 参照文献[7]，取各组细胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，500 r/min离心，用PBS清洗细胞，离心后收集细胞，用Binding buffer悬浮细胞，加入Annexin V-FITC混匀后再加入5 μL碘化丙啶室温下避光反应15 min，检测细胞凋亡率。激发波长为488 nm，发射波长为530 nm。每组设10个复孔，实验重复3次。

1.6 Western blot检测Bcl-2、Caspase-3蛋白表达参照方法[7]，把各组细胞用冰冷的0.1 mol/L PBS洗涤2次，加裂解液收集细胞，低温离心，收取上清液测定蛋白浓度并用上样缓冲液调整，煮沸10 min后加样，SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉溶液封闭，加一抗(Bcl-2单克隆抗体按1：1 200稀释，Caspase-3多克隆抗体按1：1 500稀释，GAPDH抗体按1：1 500稀释)，4 ℃过夜，加二抗(按1：5 000稀释)，室温反应2 h后ECL显影。以GAPDH为内参，采用IPP 6.0图像分析系统进行图像灰度值分析，以目的条带与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0处理数据。对4组细胞存活率、凋亡率和Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达行2×2析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞存活率和凋亡率比较 见表1。由表1可知，盐酸米诺环素、栀子苷均能提高细胞存活率，降低细胞凋亡率，且二者联合有协同效应。

表1 4组细胞存活率和凋亡率比较 %

2.2 4组细胞Hoechest 33342染色结果比较 见图1。结果显示：对照组有大量细胞核呈强蓝白色荧光；盐酸米诺环素和栀子苷组较对照组强荧光细胞(凋亡细胞)明显减少，联合应用组较单一应用组强荧光细胞减少。

A：对照组； B：盐酸米诺环素组；C：栀子苷组；D：联合应用组；图中箭头所指为凋亡细胞。图1 4组细胞Hoechest 33342染色结果(×200)

2.3 4组细胞Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平的比较 见图2、表2。由表2可知，盐酸米诺环素和栀子苷均可增加Bcl-2蛋白表达，降低Caspase-3蛋白表达，且二者联合有协同效应。

A：对照组；B：盐酸米诺环素组；C：栀子苷组；D：联合应用组。图2 各组细胞Caspase-3及Bcl-2蛋白的表达

表2 各组细胞Caspase-3及Bcl-2蛋白表达的比较

3 讨论

凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡[8]。在AD等神经退行性疾病的发生、发展过程中，细胞凋亡发挥了主要的作用。NO作为体内重要的信使分子，已证实[9-10]其过量释放可以介导脑缺血、神经损伤等病理过程进而诱导细胞凋亡。

盐酸米诺环素是一种半合成的四环素类衍生物，是一种传统的抗菌药物[11]。研究[2-3]发现，盐酸米诺环素具有神经保护作用和抗炎作用。栀子苷是中药栀子的有效成分，也是临床治疗脑水肿和醒脑中药清开灵的主要成分；资料[4]显示，栀子苷具有抗炎、抗肿瘤和神经保护作用。该研究以大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化细胞株PC12细胞为研究对象，用NO供体SIN-1诱导细胞凋亡，观察盐酸米诺环素、栀子苷单独及联合用药对细胞存活、凋亡及Caspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响。结果显示，盐酸米诺环素和栀子苷皆能提高细胞存活率，降低细胞凋亡率，且二者联用具有协同作用。

Caspase-3和Bcl-2是凋亡研究领域的热点，其中，Bcl-2是重要的抗凋亡因子[12]，Caspase-3是凋亡蛋白酶级联反应的最终通路，活化的Caspase-3切割下游相应的胞浆胞核底物导致细胞凋亡，从而发挥促凋亡作用[13]。当受到外界刺激时，体内抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白协同作用，共同决定细胞是否进入凋亡程序。该研究中Western blot检测结果显示：盐酸米诺环素、栀子苷均能使抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，促凋亡蛋白Caspase-3表达减少，二者联合应用对Caspase-3 和Bcl-2蛋白表达的影响具有协同作用。

综上所述，盐酸米诺环素、栀子苷单独及联合用药皆能抑制NO诱导的PC12细胞凋亡，且中西药联合应用效果更佳，其作用机制可能与抑制Caspase-3依赖性凋亡信号通路有关。 该研究结果为盐酸米诺环素和栀子苷在AD等神经退行性疾病预防和治疗中的应用提供了实验依据。

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(2016-05-17收稿 责任编辑徐春燕)

Effects of minocycline combined with geniposide on apoptosis of PC12 cells induced by nitric oxide

CAIZhihui1),WANGJin1),WUQiong2),CHANGQuanzhong1)

1)DepartmentofPhysiology，BasicMedicineFaculty,LuoheMedicalCollege,Luohe,Henan462002 2)DepartmentofPathophysiology,BasicMedicineFaculty，LuoheMedicalCollege,Luohe,Henan462002

minocycline；geniposide；PC12 cell；apoptosis；Caspase-3；Bcl-2

Aim: To investigate the effects of minocycline, geniposide alone or combined on the apoptosis of PC12 cells induced by nitric oxide and the possible mechanism. Methods: PC12 cells were divided into control group, minocycline group, geniposide group and the combined group. The four groups were all given 0.5 mmol/L SIN-1 to induce apoptosis, minocycline group was given 0.1 mmol/L minocycline 12 hours before the SIN-1 intervention, geniposide group was given 0.25 mmol/L geniposide, the combined group was given the 2 drugs, and control group was not given any drug.The cell survival was determined by CCK-8 method，the apoptosis was observed by Hoechest 33342 fluorescent staining，the apoptosis rate was measured by flow cytometry，the expressions of the apoptotic related proteins Caspase-3 and Bcl-2 were detected by Western blot. Results: Compared with control group, the cell viability improved, the apoptosis rate decreased, the expression of Bcl-2 upregulated, and that of Caspase-3 downregulated in minocycline group and geniposide group(P<0.05); minocycline and geniposide had synergistic effects on the above indicators(P<0.05). Conclusion: Minocycline and geniposide both can inhibit the apoptosis of PC12 cells,but the effect of the combined application is superior to the single application. The mechanism may be related to the inhibition of Caspase-3 dependent apoptosis signaling pathways.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.012

*河南省科技厅基础与前沿技术研究基金资助项目 152300410014；河南省教育厅高等学校重点科研项目 16A180031；漯河医学高等专科学校博士基金资助项目 2014DF001；漯河医学高等专科学校校级研究项目 2016-S-LMC-9

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