IRE1通路在染氟雄性大鼠生殖损伤中的作用*

闫 婷，黄 辉，冯得敏，巴 月，程学敏，崔留欣#

1)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 450001 2)郑州大学第三附属医院病案科 郑州 450052

IRE1通路在染氟雄性大鼠生殖损伤中的作用*

闫 婷1)，黄 辉1)，冯得敏2)，巴 月1)，程学敏1)，崔留欣1)#

1)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 450001 2)郑州大学第三附属医院病案科 郑州 450052

#通信作者，男，1955年5月生，本科，教授，研究方向：环境毒理学，E-mail:clx@zzu.edu.cn

氟；内质网应激；IRE1通路；生殖系统；大鼠

目的：探讨内质网应激IRE1通路在染氟雄性大鼠生殖系统中的作用。方法：60只4周龄SD雄性大鼠随机分为4组，包括对照组、NaF组、NAC组和NaF+NAC组，每组15只，采用等体积经口灌胃方式处理，每周灌胃6 d停灌1 d，连续灌胃7周。然后测定睾丸脏器系数，酶联免疫法测定血清中睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)含量，TUNEL法检测睾丸细胞凋亡情况，qRT-PCR法检测大鼠睾丸组织中IRE1及JNK mRNA的相对表达量，Western blot法检测大鼠睾丸组织中IRE1、p-IRE1、JNK和p-JNK蛋白的相对表达量。结果：与对照组相比，NaF组体重及睾丸质量减轻，血清T含量降低，血清FSH、LH含量升高，大鼠睾丸细胞凋亡指数升高，大鼠睾丸组织中IRE1及JNK mRNA表达水平均升高，p-IRE1及p-JNK蛋白表达水平均升高(P均<0.05)。与NaF组比较，NaF+NAC组大鼠睾丸细胞凋亡指数降低，大鼠睾丸组织中IRE1及JNK mRNA表达水平均下降，p-JNK蛋白表达水平下降(P均<0.05)。结论：氟暴露可以诱发内质网应激IRE1通路介导的JNK凋亡信号通路；NAC抑制内质网应激，对氟致雄性大鼠生殖损伤起到了一定的拮抗作用。

长期摄入过量氟会导致慢性全身性中毒改变，除可引起骨骼系统的明显损害外，对非骨相系统也有严重影响，如对生殖系统的损伤作用[1]。目前研究[2]发现氟斑牙和氟骨症的发生可能与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有关，那么氟致生殖损伤是否与ERS有关值得进一步研究。未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)本身作为一种适应性的反应机制，对机体具有保护作用，但是如果ERS持续时间过长，UPR信号转导通路则会激活ERS特异性的促凋亡因子的表达，诱导细胞凋亡。UPR信号转导通路由3种主要的跨膜蛋白起始：双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶、肌醇需求激酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)以及活化转录因子6介导不同的凋亡信号通路。IRE1α结合其下游的肿瘤坏死因子受体相关因子2激活ASK1-JNK信号通路，JNK通过调节Bcl-2家族成员分子的活性等机制促使细胞凋亡[3]。但是IRE1介导的通路是否参与了氟诱导生殖系统细胞凋亡过程，尚不明确。该研究通过建立氟染毒大鼠模型，并以N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为干预剂，探讨IRE1介导的JNK凋亡通路是否参与了氟染毒大鼠睾丸细胞的凋亡过程。

1 材料与方法

1.1 材料 选定SPF级4周龄雄性SD大鼠60只，体重100～150 g[由河南省实验动物中心提供，动物生产许可证编号为 SCXK(豫)2010-0002]，普通饲料购自河南省实验动物中心。血清睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)酶联免疫法测定试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。RNA逆转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，qRT-PCR法检测IRE1及JNK mRNA的表达采用MX3000P RT-PCR 仪，DNA引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。兔抗鼠 IRE1 抗体购自美国Abcam公司，兔抗鼠JNK抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，GAPDH 抗体购自南京诺唯赞生物科技有限公司，二抗均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验分组 将大鼠按体重采用随机数字表法分为对照组、NaF组、NAC组、NaF+NAC组4组，每组15只。在屏障动物房检疫1周后，对照组给予10 mL/kg生理盐水；NaF组按25 mg/(kg·d)给予NaF溶液；NAC组给予150 mg/(kg·d) NAC；NaF+NAC组则先给予150 mg/(kg·d)NAC，0.5 h后以25 mg/(kg·d)NaF进行灌胃处理。每周连续灌胃6 d后，停灌1 d，共灌胃7周。然后进行以下检测。

1.3 检测指标

1.3.1 动物体重、睾丸质量的测定及睾丸脏器系数的计算 染毒 7 周结束后，测量各组大鼠体重，麻醉并处死后，立即取睾丸称重，计算其脏器系数。脏器系数=脏器湿重(g)/体重(g)×100%。

1.3.2 血清T、FSH、LH水平的测定 染毒结束后，麻醉抽取腹主动脉血，离心分离得血清，采用酶联免疫法测定血清T、FSH、LH的含量。

1.3.3 睾丸细胞凋亡指数的TUNEL法检测 按照TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒说明书进行操作，光学显微镜下观察组织切片，凋亡细胞呈棕色，正常细胞呈蓝紫色。每例标本选取 5个400倍视野，观察细胞凋亡情况，每例标本总计数不少于500个细胞，并计算凋亡细胞占细胞总数的百分比，即凋亡指数。

1.3.4 大鼠睾丸组织中IRE1及JNK mRNA表达水平的qRT-PCR法检测 采用Trizol提取总RNA，酶标仪测RNA 浓度及纯度。严格按照试剂盒说明书进行操作，PCR引物序列见表1。反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，模板DNA 2 μL，无RNase水6.8 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环；融解曲线分析过程：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt相对定量法计算目的基因的相对表达量。

表1 PCR引物

1.3.5 大鼠睾丸组织中IRE1、p-IRE1及JNK、p-JNK蛋白表达水平的Western blot法检测 称取0.1 g睾丸组织于处理过的匀浆器中，加入1 mL RIPA细胞裂解液在冰中匀浆，处理后继续在冰上孵育20 min使细胞充分裂解，以14 000×g、4 ℃离心10 min后转移上清液至新的离心管中，用BCA法测定蛋白浓度。取约50 μg蛋白经电泳分离后，290 mA恒流转移到PVDF膜上，于37 ℃恒温封闭2 h，用TBST洗涤30 min后，滴加一抗4 ℃过夜，再次洗涤30 min，37 ℃二抗恒温孵育30 min，ECL化学发光法显色。采用Amersham Imager 600化学发光成像仪采集图像，并用ImageQuant TL软件对图像进行灰度分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0进行统计学分析。不同组间大鼠体重、睾丸质量、睾丸脏器系数，血清T、FSH、TH水平，睾丸细胞凋亡指数，睾丸组织IRE1、JNK mRNA相对表达量和IRE1、JNK、p-IRE1、p-JNK蛋白相对表达量的比较均采用2×2析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组大鼠体重、睾丸质量及其脏器系数的比较结果见表2。

2.2 4组大鼠睾丸组织细胞凋亡检测结果 见图1、表3。与对照组比较，NaF组大鼠睾丸组织中可见大量棕褐色和棕黄色凋亡细胞，NaF+NAC组大鼠睾丸组织中凋亡细胞相对减少。

表2 4组大鼠体重、睾丸质量及其脏器系数的比较

A:对照组；B:NAC组；C:NaF组；D:NaF+NAC组；箭头示凋亡细胞。图1 4组大鼠睾丸细胞凋亡情况的检测(TUNEL,×400)

表3 4组大鼠睾丸细胞凋亡指数测定结果 %

FNAC=75.303，FNaF=468.690，F交互=78.090，P均<0.001。

2.3 4组大鼠血清T、FSH、LH水平的比较 结果见表4。

表4 4组大鼠血清T、FSH、LH水平的比较

2.4 ERS对细胞凋亡相关因子mRNA和蛋白表达的影响 4组大鼠睾丸组织中IRE1和JNK mRNA的表达，以及IRE1、JNK、p-IRE1、p-JNK蛋白表达的比较见图2、表5。

图2 4组大鼠IRE1、p-IRE1、JNK和p-JNK Western blot检测结果

3 讨论

近20 a的研究[4]发现，氟对雄性生殖系统有严重危害，氟暴露能降低精子质量和数量、T等激素水平以及相关酶的活力。氟化物通过影响动物血清下丘脑-垂体-睾丸轴多种生殖激素水平，而表现出生殖内分泌干扰作用。该研究结果显示氟暴露组血清中T含量明显降低，FSH和LH含量升高，这与孙发等[5]研究结果相一致，说明氟可以破坏睾丸间质细胞的结构和功能，造成T合成和分泌障碍。有人群流行病学调查研究[6]显示，调查区水中氟浓度为3.89 mg/L，超过我国规定的饮用水氟含量(1.5 mg/L)，调查区人群血清中T含量明显低于对照组，LH含量明显高于对照组，且氟对男性生殖激素的影响大于女性。马晓英等[7]通过动物实验发现氟暴露可以破坏睾丸组织结构，使间质细胞分泌T受到影响，染氟组大鼠血清中GnRH、FSH和E2含量明显高于对照组，染氟组血清中T含量低于对照组且高氟组低于低氟组，说明氟可以干扰下丘脑-垂体-睾丸轴调节生殖激素水平的能力，损伤睾丸间质细胞导致血清T水平降低，负反馈调节机制发挥作用，调控下丘脑和垂体分泌激素功能致使FSH、LH水平升高。

ERS参与了许多病理过程，例如糖尿病、神经系统疾病、内分泌系统疾病、肿瘤及细胞凋亡等。在ERS中，存在3条可以导致细胞凋亡发生的信号通路：Caspase级联反应信号通路、CHOP信号通路以及JNK信号通路[8]。该研究结果显示，对照组大鼠睾丸组织无或偶见睾丸细胞凋亡，NaF组大鼠睾丸组织切片中可见大量棕褐色和棕黄凋亡细胞，睾丸细胞凋亡指数明显升高，且大鼠睾丸细胞中IRE1及JNK mRNA表达水平明显升高，说明氟可以通过ERS促进睾丸细胞的凋亡。杨阳等[9]发现,氟染毒可以通过ERS反应引起睾丸支持细胞的凋亡，细胞凋亡指数明显升高。JI等[10]发现镉染毒可以使大鼠睾丸细胞中GRP78及p-JNK蛋白表达升高，促进ERS介导的细胞凋亡，造成大鼠生殖损伤。FU等[11]发现NaF能够破坏正常细胞的3个胚芽层和成骨细胞的分化从而干预人体早期的胚胎发育，而且高剂量的NaF通过JNK依赖途径引起细胞凋亡。在ERS状态下，含IRE1α基因的重组腺病毒感染可促进ATDC5软骨干细胞的凋亡[12-13]。

NAC是还原型谷胱甘肽的前体，由于其分子内含有活性巯基，可有效对抗机体内的氧化损伤作用。NAC不仅是抗氧化剂，还有抑制ERS的作用。杨阳等[9]通过细胞实验证明，NAC可有效抑制氟染毒对睾丸支持细胞的ERS损伤。有研究[10]显示，NAC可以通过抑制镉染毒引起的睾丸细胞ERS有效抑制细胞凋亡，从而起到保护睾丸的作用。该实验结果显示，NAC干预可明显下调IRE1和JNK mRNA表达水平，细胞凋亡指数和p-JNK蛋白表达水平与氟暴露组相比显著下降，说明NAC可以拮抗ERS反应，抑制细胞凋亡发生，与上述研究结果一致。

综上所述，氟染毒可参与ERS、IRE1介导的JNK凋亡信号通路促进睾丸细胞的凋亡，继而引起氟对生殖系统的损伤作用，NAC可抑制ERS，从而抑制细胞凋亡，对氟染毒大鼠生殖损伤起到了一定的拮抗作用。

[1]李薛燕,黄文丽.氟中毒致机体损伤及其机制[J].国外医学(医学地理分册),2015,36(3):186

[2]马林,张颖,张凯强,等.内质网应激诱导细胞凋亡的机制及其在氟斑牙形成中的作用[J].中国实用口腔科杂志,2013,6(6):379

[3]ZENG T,PENG L,CHAO H,et al.IRE1α-TRAF2-ASK1 complex-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to CXC195-induced apoptosis in human bladder carcinoma T24 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,460(3):530

[4]FENG D,HUANG H,YANG Y,et al.Ameliorative effects of N-acetylcysteine on fluoride-induced oxidative stress and DNA damage in male rats′ testis[J].Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen,2015,792:35

[5]孙发,李崇斌,肖跃海,等.燃煤型氟中毒对雄性大鼠生殖内分泌激素的影响[J].基础医学与临床,2011,31(10):1077

[6]郝鹏飞,马晓英,程学敏,等.氟对暴露人群下丘脑-垂体-性腺轴激素水平的影响[J].卫生研究,2010,39(1):53

[7]马晓英,程学敏,李富冉,等.氟对雄性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴内分泌干扰作用的实验研究[J].卫生研究,2008,37(6):733

[8]李敏,林俊.细胞凋亡途径及其机制[J].国际妇产科学杂志,2014，41(2):103

[9]杨阳,黄辉,袁伟,等.氟对原代培养大鼠睾丸支持细胞氧化应激和凋亡的影响[J].卫生研究,2013,42(6):1004

[10]JI YL,WANG H,ZHANG C,et al.N-acetylcysteine protects against cadmium-induced germ cell apoptosis by inhibiting endoplasmic reticulum stress in testes[J].Asian J Androl,2013,15(2):290

[11]FU X,XIE FN,DONG P,et al.High-dose fluoride impairs the properties of human embryonic stem cells via JNK signaling[J].PLoS One,2016,11(2):e0148819

[12]李祥柱,张鹏,韩晓凤,等.IRE1α重组腺病毒载体对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响[J].解放军医学杂志,2013,38(8):639

[13]DENG H,KUANG P,CUI H,et al.Sodium fluoride(NaF) induces the splenic apoptosis via endoplasmic reticulum(ER) stress pathwayinvivoandinvitro[J].Aging(Albany NY),2016,8(12):3552

(2016-10-10收稿 责任编辑姜春霞)

Role of IRE1 pathway in fluoride-exposed male rat reproductive system injury

YANTing1),HUANGHui1),FENGDemin2),BAYue1),CHENGXuemin1),CUILiuxin1)

1)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofMedicalRecord,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

fluorine;endoplasmic reticulum stress;IRE1 pathway;reproductive system;rat

Aim: To research the role of IRE1 endoplasmic reticulum stress pathway in the fluoride-exposed male rat reproductive system injury. Methods: A total of sixty healthy male SD rats(4 weeks old) were divided into 4 groups randomly，including control group, NAC group, NaF group and NaF+NAC group. Each group had 15 rats. The rats were administered for 7 weeks，during which the rats were continuously treated by gavage for 6 days per week. Weight coefficient of testises was assayed. Testosterone(T), follicle stimulating hormone(FSH) and luteinizing hormone(LH) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. TUNEL method was used to detect testis cell apoptosis. IRE1 and JNK mRNA expression levels were detected by qRT-PCR. IRE1, p-IRE1, JNK and p-JNK protein expression levels were assayed by Western blot. Results: Compared with control group, in NaF group body weight and testicular weight were decreased, serum T level was decreased, serum FSH and LH levels were elevated, testicular apoptosis index was increased, the expression levels of IRE1 and JNK mRNA were increased, and protein expression levels of p-IRE1 and p-JNK were also increased significantly(P<0.05). Compared with NaF group, in NaF+NAC group the apoptosis index was reduced, the expression levels of IRE1 and JNK mRNA were down-regulated, and protein expression level of p-JNK was decreased significantly(P<0.05). Conclusion: Fluorine exposure could induce endoplasmic reticulum stress, and activate IRE1 mediated JNK apoptosis signaling pathway. NAC could inhibit endoplasmic reticulum stress, playing a protective role in fluoride-exposed male rat reproductive system injury.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.007

*河南省教育厅科学技术研究重点项目 13A330735

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